綿羊依諾肝素鈉化合物的制備方法及其化合物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種依諾肝素鈉化合物的制備方法，尤其涉及一種綿羊依諾肝素鈉化 合物的制備方法，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝素是一種硫酸化酸性多糖酯類物質(zhì)，由動物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生分泌，是 目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗凝抗栓藥物。其中，依諾肝素鈉（EnoxaparinSodium，ES)是一 種低分子的肝素鈉鹽，是臨床上最為重要的肝素類抗凝劑之一，全球年銷售量超30億美元 以上。肝素最早在狗的肝臟中被發(fā)現(xiàn)，所以被稱做肝素。但實(shí)際上肝素在哺乳動物體內(nèi)分 布很廣，在心、肝臟、肺、腸粘膜、十二指腸和血管壁中均存在，肝素最早得自肝臟，但以腸粘 膜和肺臟中含量最為豐富，醫(yī)用肝素的主要來源是豬腸粘膜肝素，但牛肝素和羊肝素（主 要是綿羊肝素）在某些地區(qū)也有使用，市場上銷售的依諾肝素鈉，是由天然大分子肝素解 聚而來。
[0003] 依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)如下所示：
[0004]
[0005] 依諾肝素鈉和天然肝素的分子結(jié)構(gòu)一樣，都是由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸（90% 艾杜糖醛酸、10%葡萄糖醛酸）中的一種組成二糖重復(fù)單元，與其他肝素相比，其結(jié)構(gòu)特征 在于：在糖鏈的非還原端處存在C4-C5不飽和雙鍵，并在還原末端具有一定量的1，6-酐衍 生物。此外，相對于天然肝素，低分子的依諾肝素鈉分子量分布更為集中，USP37和EP8. 0均 要求其重均分子量在3800-5000之間，分子量〈2000的低聚糖質(zhì)量百分比在12-20%之間， 分子量2000-8000的低聚糖質(zhì)量百分比在68% -82%之間。
[0006] 美國專利US005389618A介紹了依諾肝素鈉的制備方法，即豬腸粘膜肝素經(jīng)芐基 酯化再堿解聚，其基本步驟為：以豬粘膜肝素為起始原料，經(jīng)肝素季銨鹽制備、肝素芐酯制 備、對肝素芐酯進(jìn)行堿解聚、以酸中和、醇沉淀，精制、脫色、干燥，得到依諾肝素鈉成品。
[0007] 美國藥典和歐洲藥典等還對依諾肝素鈉的質(zhì)量控制有著嚴(yán)格的要求，如美國藥典 37版（USP37)對依諾肝素鈉的要求，主要為：
[0008] 1)生產(chǎn)：依諾肝素鈉是由豬腸粘膜提取的肝素鈉經(jīng)酯化后得到的肝素芐基酯鈉 衍生物通過堿裂解生成的低分子量肝素鈉，其結(jié)構(gòu)必須符合定義下的要求，生產(chǎn)過程必須 經(jīng)過驗(yàn)證以證實(shí)能夠去除病毒和另外的感染源。
[0009] 2)鑒別：依諾肝素鈉重均分子量在3800-5000之間，分子量〈2000的低聚糖質(zhì)量 百分比在12-20%之間，分子量2000-8000的低聚糖質(zhì)量百分比在68% -82% ;按干品計(jì)每 毫克抗Xa因子的效價(jià)在90-125單位，每毫克抗IIa因子的效價(jià)在20-35單位，抗Xa與抗 IIa的比值在3. 3-5. 3之間；1，6-酐環(huán)結(jié)構(gòu)低聚糖鏈的百分?jǐn)?shù)是依諾肝素鈉低聚糖混合物 的特征，藥典中規(guī)定其1，6-酐環(huán)結(jié)構(gòu)需占全部糖單元的15% -25%。
[0010] 3)測試：溶液外觀：1. 0克溶于10毫升水，溶液澄清，按最接近標(biāo)準(zhǔn)比色液的顏色 比較不得超過6號色；pH: 1. 0克溶于去除二氧化碳的10毫升水，pH為6. 2-7. 7 ;特征吸收： 50. 0毫克溶于100毫升的0. 01摩爾每升鹽酸，在231納米波長檢測，折干后為14-20 ;苯 甲醇?xì)埩簦翰怀^0. 1% ;鈉含量：折干后為11. 3% -13. 5% ;磺酸根/羧酸根比例：不小于 1. 8 ;甲醇?xì)埩簦翰淮笥?000ppm等等。
[0011] 雖然USP37和EP8. 0都規(guī)定依諾肝素鈉是豬腸粘膜肝素來源的，但是豬肝素仍有 明顯的缺陷。如當(dāng)前的美國市場，其肝素制品（新藥、仿制藥、器械等）均來自豬腸黏膜，然 而，其中75%用于生產(chǎn)精品肝素的粗品來自美國以外，超過一半來自中國，單一動物和地區(qū) 來源，存在著嚴(yán)重的不可控風(fēng)險(xiǎn)（如豬藍(lán)耳病等）。豬腸粘膜肝素的供應(yīng)鏈極為復(fù)雜，在中 國存在著大量的養(yǎng)殖散戶，提取1億單位的肝素需要1500頭以上生豬的腸粘膜，供應(yīng)和生 產(chǎn)鏈涉及到養(yǎng)殖戶、屠宰廠、粗品肝素生產(chǎn)廠、粗品肝素經(jīng)銷商、精品肝素生產(chǎn)廠和精品肝 素經(jīng)銷商等一系列的環(huán)節(jié)，各個(gè)環(huán)節(jié)都容易出風(fēng)險(xiǎn)。2008年中國供美的肝素就發(fā)生過嚴(yán)重 的污染事件，揭示豬肝素這種單一供應(yīng)是極其脆弱的。
[0012] 眾所周知，牛羊與豬不同，其主產(chǎn)在國外，多為集約化的大規(guī)模養(yǎng)殖和集中屠宰， 相比與豬主產(chǎn)在中國的散養(yǎng)散屠宰等，風(fēng)險(xiǎn)控制上的差異顯而易見。開發(fā)牛、羊肝素是 當(dāng)今豬肝素的重要和有益補(bǔ)充。早在1939年，牛肝素就已在美國上市，在美國市場上也 存在了 50余年。在上世紀(jì)90年代，歐美爆發(fā)了令西方人聞之色變的瘋牛病（BSE，Bovine spongiformencephalopathy，牛海綿狀腦?。?，由于擔(dān)心BSE的污染，作為牛源生化制品的 牛肝素因非醫(yī)療原因自動退出了市場，但BSE的陰影仍然無處不在。因此，綜合來看，羊肝 素要容易被人們接受得多。
[0013] 此外，不是所有的肝素都適合用于制備依諾肝素鈉。如前所述，雖然不同動物或器 官來源的肝素均為重復(fù)的二糖單元所組成，但二糖的種類、數(shù)量、糖單元上各個(gè)位置的修飾 多少與方式等都有不同，這些都使得肝素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變。肝素是世界上迄今為止已知 的分子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的化合物，無法人工化學(xué)合成。本申請人經(jīng)過大量詳實(shí)的結(jié)構(gòu)表征試驗(yàn) 和分析，包括分子量分布分析、二糖組成分析、核磁共振氫譜碳譜分析和生物學(xué)抗凝活性分 析等，發(fā)現(xiàn)與牛腸粘膜肝素、牛肺肝素和山羊腸粘膜肝素等相比，綿羊腸粘膜肝素與豬腸粘 膜肝素最為接近，適合于制備依諾肝素鈉。
[0014] 依諾肝素鈉的制備和分析表征紛繁復(fù)雜，工藝和技術(shù)要求極高，目前沒有文獻(xiàn)系 統(tǒng)地研究不同動物來源和器官制備依諾肝素鈉，沒有它們相互間的物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì) 的比較，市場上也沒有此類產(chǎn)品，更遑論合格的牛、羊依諾肝素鈉產(chǎn)品。
[0015] 中國專利申請?zhí)?01210064430. 0,介紹了一種牛肺肝素生產(chǎn)清真依諾肝素鈉的生 產(chǎn)純化方法，但此文沒有說明牛肺肝素和豬腸粘膜肝素在理化性質(zhì)上的區(qū)別，更沒有說明 和數(shù)據(jù)比較此類區(qū)別會導(dǎo)致相同工藝下生產(chǎn)出的產(chǎn)品的異同。其公布制備工藝的核心芐酯 化和堿解聚步驟的條件與美國專利US005389618A及其姊妹專利所列的相同，但遵照此中 國專利申請所公布的技術(shù)無法獲得合格的牛肺依諾肝素鈉。另外，此中國專利申請沒有對 依諾肝素鈉特征的核心指標(biāo)一一1，6-酐環(huán)百分含量進(jìn)行測試，按照其具體實(shí)施例一的制備 和純化，得到的1，6_酐環(huán)百分含量也不在USP37和EP8.0規(guī)定的15% -25%之間，并不具 真正意義上的實(shí)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種綿羊依諾肝素鈉化合物 的制備方法。
[0017] 本發(fā)明的目的，將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
[0018] 綿羊依諾肝素鈉化合物的制備方法，包括如下步驟，
[0019]S1、原料綿羊腸粘膜肝素的預(yù)處理，將綿羊腸粘膜肝素鈉溶解于濃度為1% -3% 的氯化鈉水溶液中形成綿羊腸粘膜肝素溶液，對所述綿羊腸粘膜肝素溶液進(jìn)行精過濾，再 在室溫下進(jìn)行醇沉精制，收集沉淀物，干燥獲得綿羊腸粘膜肝素，所述醇沉精制可進(jìn)行多 次，直至所述綿羊腸粘膜肝素的水溶液澄清且色度不深于5號標(biāo)準(zhǔn)色，綿羊血漿法抗凝活 性折干后不少于130單位每毫克，硫酸皮膚素的含量不高于1% ;
[0020]S2、綿羊腸粘膜肝素季銨鹽的制備，將S1中獲得的綿羊腸粘膜肝素鈉溶解配制成 綿羊腸粘膜肝素水溶液，并與芐索氯銨水溶液進(jìn)行混合，過濾或離心獲得綿羊腸粘膜肝素 季銨鹽，并進(jìn)行洗滌干燥；
[0021]S3、綿羊腸粘膜肝素芐酯的制備，將S2中干燥得到的綿羊腸粘膜肝素季銨鹽與二 氯甲烷及氯化芐按重量比例混合酯化，酯化溫度為30°C-40°C，所述綿羊腸粘膜肝素季銨 鹽：二氯甲烷：氯化芐為1:3~10:1~2 ;在酯化后的綿羊腸粘膜肝素季銨鹽中滴加醋酸 鈉甲醇溶液，制得綿羊腸粘膜肝素芐基酯沉淀，將綿羊腸粘膜肝素芐基酯沉淀進(jìn)行過濾、洗 滌、干燥，制得綿羊腸粘膜肝素芐基酯，所述綿羊腸粘膜肝素芐基酯折干后的酯化度不小于 9. 5% ；
[0022] S4、綿羊依諾肝素鈉成品制得，將S3中的綿羊腸粘膜肝素芐基酯進(jìn)行堿解聚、脫 色、以酸中和至中性、醇沉淀，精制、干燥，得到綿羊依諾肝素鈉成品。所述成品的具體制 得方法，指將S3中得到的綿羊腸粘膜肝素芐基酯溶解于10-40倍重量的水中，加熱溶液至 30°C-70°C之間，保溫使溫度穩(wěn)定，充分?jǐn)嚢柘录尤?. 05-0. 5倍綿羊腸粘膜肝素芐基酯重 量的氫氧化鈉固體粉末（或相當(dāng)摩爾數(shù)量的10% -50%氫氧化鈉溶液），繼續(xù)攪拌保溫0. 5 小時(shí)以上將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入0. 1-1倍綿羊腸粘膜肝素芐基酯重量的30%雙氧水， 氧化脫色10分鐘以上。用稀鹽酸調(diào)pH至中性，精過濾。濾液加氯化鈉至8-12%濃度，調(diào) pH至5. 8-6. 2,再精過濾。加入2-4倍反應(yīng)溶液體積的甲醇，沉降、過濾或離心，得到綿羊依 諾肝素鈉沉淀。綿羊依諾肝素鈉沉淀物可用之前相同體積的甲醇再重懸攪拌洗滌，沉降、過 濾或離心，終產(chǎn)品干燥后分裝保存。所述雙氧水也可以采用其他濃度。所述綿羊依諾肝素 鈉成品重均分子量在3800-5000之間，其中分子量〈2000部分的比例在12. 0% -20. 0%之 間，2000〈分子量〈8000部分的比例在68. 0 % -82. 0 %之間，分子量>8000部分的比例不超 過18. 0% ;1，6-酐含量在15%-25%之間；抗Xa活性折干后在90-125單位每毫克之間， 抗IIa活性折干后在20-35單位每毫克之間，抗Xa/抗IIa比例在3. 3-5. 3之間。
[0023] 優(yōu)選地，所述S1中醇沉精制的沉淀劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丙