素鈉的氫譜差異最小。
[0114] 綜合以上各項測試，無論從分子量分布、二糖組成和氫譜，還是從生物學抗凝活性 上來看，綿羊腸粘膜肝素鈉均與豬腸粘膜肝素鈉更為接近，兩者性質(zhì)差異最小。
[0115] 實施例一
[0116] 綿羊腸粘膜肝素鈉，根據(jù)本領域所熟知的通用肝素純化方法在蘇州融析生物科技 有限公司進行純化制備。經(jīng)檢測，其綿羊血漿法抗凝活性折干后為166. 8單位每毫克，且5 萬單位產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，澄清且色度不深于5號標準色。
[0117] 準確稱取上述綿羊腸粘膜肝素鈉50克，溶解于500毫升水中；另將125. 0克芐索 氯銨，溶解于500毫升水中，配制成澄清的芐索氯銨水溶液；于充分攪拌下，將芐索氯銨水 溶液滴加至肝素水溶液中，30分鐘內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)攪拌2小時。用高速離心機6000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心5分鐘，沉淀用1000毫升水重懸，繼續(xù)充分攪拌5分鐘，再6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘。重復一次。沉淀的綿羊腸粘膜肝素季銨鹽，45°C鼓風干燥10小時后，轉(zhuǎn)移至真空干 燥箱，在60°C下真空干燥48小時。干燥后的綿羊腸粘膜肝素季銨鹽的干燥失重為0. 7%， 稱重為145. 3克。
[0118] 取上述干燥后的綿羊腸粘膜肝素季銨鹽140. 0克于10升反應釜中，加入840. 0克 二氯甲烷攪拌溶解，升溫至38 °C，加入160. 0克氯化芐，全程保溫30-40 °C，反應過夜（=25 小時）。另外，稱量85. 0克醋酸鈉，溶解于800毫升的甲醇中，在酯化反應結(jié)束后滴加至反 應液中，此時產(chǎn)生不溶的綿羊腸粘膜肝素芐基酯沉淀。再加入2升甲醇，攪拌5分鐘，靜置 過夜。小心地吸去上清液，下層沉降區(qū)混合物，用100目濾布抽濾，得到綿羊腸粘膜肝素芐 基酯粗品。粗品再兩次以1升甲醇重懸，充分攪拌洗滌后抽濾。稱取14. 0克氯化鈉并溶于 100. 0毫升水中，用該氯化鈉水溶液溶解上述固體，再以1升的甲醇醇沉，沉淀物以離心機 6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收獲。重復鹽水溶再甲醇醇沉3次，沉淀轉(zhuǎn)移至真空干燥箱，60°C 真空干燥50小時。所得的綿羊腸粘膜肝素芐基酯稱重47. 3克，干燥失重為3. 1%，酯化度 折干后為12.4%。
[0119] 取上述綿羊腸粘膜肝素芐基酯45.0克，溶于1.0升水中，加熱至60°C，保溫 60± 1°C30分鐘以上。另外準確稱取5克50%氫氧化鈉溶液，加入上述保溫的水溶液中，繼 續(xù)攪拌保溫60 ± 1°C，反應90分鐘。將反應液冷卻至室溫，加入22. 5克30 %雙氧水，氧化 脫色30分鐘。用稀鹽酸調(diào)pH至7. 0,0. 22微米過濾反應液。濾液加100. 0克氯化鈉，攪拌 確保氯化鈉全溶，調(diào)pH至6.0,再0.22微米精過濾。加入3升甲醇醇沉，沉淀物經(jīng)400目過 濾。沉淀物再以3升甲醇重懸攪拌30分鐘，抽濾取沉淀。沉淀溶于80.0克水后，轉(zhuǎn)移至凍 干瓶，真空凍干30小時。凍干粉稱重后裝袋，密封送檢。
[0120] 最終收獲綿羊依諾肝素鈉25. 2克，按初始投料計重量收率55. 0 %，干燥失重為 3. 7%。均重分子量為4237,分子量〈2000部分的比例為17. 3%，2000〈分子量〈8000部分 的比例為73. 0 %，分子量>8000部分的比例為9. 7 % ; 1，6-酐環(huán)糖鏈占總糖鏈為23. 9 %。 抗Xa活性折干后為105. 6單位每毫克，抗IIa活性折干后為29. 0單位每毫克，抗Xa/抗 IIa比例為3. 6 ;1. 0克產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，澄清且色度不深于6號標準色；1. 0克 產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，pH為6. 83 ;鈉含量折干后為12. 8% ;氮含量折干后為2. 0% ; 水溶液在232納米波長有最大吸收，折干后231納米特征吸收為14. 5 ;磺酸根/羧酸根比 例為1. 9 ;有關物質(zhì)芐醇含量折干后不大于0. 1 %，芐銨鹽含量折干后不大于0. 1 %;重金屬 殘留不大于30ppm;溶劑殘留中甲醇為2700ppm;細菌內(nèi)毒素含量，每抗Xa單位活性依諾 肝素鈉小于〇. 01細菌內(nèi)毒素單位（EU)。以上所有指標，除肝素來源外，均符合USP37依諾 肝素鈉的放行標準。
[0121] 實施例二
[0122] 取蘇州生物科技有限公司制備的綿羊腸粘膜肝素鈉2. 0千克，其綿羊血漿法抗凝 活性折干后為171. 5單位每毫克，且5萬單位產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，澄清且色度不深 于5號標準色。制備綿羊依諾肝素鈉的過程同實施例1，僅試劑使用量上的差異。最終獲得 綿羊依諾肝素鈉1. 16Kg，按初始投料計重量收率58. 0%，干燥失重為3. 4%。; 1. 0克產(chǎn)品溶 于10毫升水的溶液，澄清且色度不深于6號標準色；1. 0克產(chǎn)品溶于10毫升水的溶液，pH 為7. 4 ;鈉含量折干后為11. 5 % ;氮含量折干后為2. 2% ;水溶液在232納米波長有最大吸 收，折干后231納米特征吸收為15. 8 ;磺酸根/羧酸根比例為2. 2 ;有關物質(zhì)芐醇含量折干 后不大于〇. 1 %，芐銨鹽含量折干后不大于〇. 1 %;重金屬殘留不大于30ppm;溶劑殘留中甲 醇為1400ppm;細菌內(nèi)毒素含量，每抗Xa單位活性依諾肝素鈉小于0. 01細菌內(nèi)毒素單位。 以上所有測試結(jié)果，均符合USP37依諾肝素鈉的放行標準。
[0123] 綿羊依諾肝素鈉重均分子量及分子量分布分析
[0124] 綿羊依諾肝素鈉的分子量分布，參照USP37方法進行，其色譜條件如表7所示。
[0125] 表7:綿羊依諾肝素鈉樣品分子量分布的分析方法
[0126]
[0127]
[0128] 分子量校準：美國藥典依諾肝素鈉分子量標準品ARS和美國藥典依諾肝素鈉分 子量標準品BRS，各以流動相配制成10毫克每毫升溶液，0. 22微米過濾后進樣，校準對應 保留時間內(nèi)的色譜信號響應。
[0129] 稱取實施例二中的綿羊依諾肝素鈉10毫克，按重量溶解于流動相中，配制成10毫 克每毫升溶液，〇. 22微米過濾后進樣。
[0130] 各樣品的分析結(jié)束后，以Agilent-GPC軟件計算各自重均分子量及分子量分布， 結(jié)果如附圖4和表8所列。
[0131] 表8 :綿羊依諾肝素鈉樣品的重均分子量及分子量分布
[0132]
[0133] 表格中的綿羊依諾肝素鈉（Ovine-038)來自于實施例二所制備的產(chǎn)品。
[0134] 結(jié)果可以看出，實施例二中制備的綿羊依諾肝素鈉，其均重分子量和分子量分布 與來源于豬腸粘膜的依諾肝素鈉標準品非常接近，符合USP37技術(shù)指標的要求，均重分子 量和分子量分布是合格的。
[0135] 綿羊依諾肝素鈉二糖和1，6-酐含量分析
[0136] 綿羊依諾肝素鈉的二糖組成分析，遵照USP32附錄〈207>"依諾肝素鈉的1，6-酐衍 生物檢查"進行。肝素酶采用自研及出售的肝素酶1、2、3,其性質(zhì)可完美替代FDA推薦酶產(chǎn) 品。酶解后的二糖溶液經(jīng)0.22微米過濾后進行強陰離子交換-高壓液相色譜（SAX-HPLC) 分析，對照品用賽諾菲的市售藥物克賽凍干粉按相同方法分析。
[0137] 酶解及樣品制備如下：
[0138] 步驟⑴：綿羊依諾肝素鈉樣品和對照標準品的完全酶解
[0139]a、完全酶解步驟中溶液的配制：
[0140] 溶液A:稱取136毫克的磷酸二氫鉀，用約40毫升的超純水溶液后，以2摩爾每升 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0,加入20毫克的小牛白蛋白，搖勻，并以超純水定容到100毫 升，過濾得到10毫摩爾每升的磷酸二氫鉀溶液。
[0141] 溶液B:移取0. 57毫升的冰醋酸于燒杯中，加入約80毫升的超純水，加入32毫克 的醋酸鈣，攪拌使之溶解。以2摩爾每升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0,加入10毫克小牛 白蛋白，搖勻，并以超純水定容到100毫升，過濾得到100毫摩爾每升的醋酸鈉溶液。
[0142] 溶液C:稱取90毫克硼氫化鈉，溶于1000微升超純水中，渦旋混勻，0. 22微米濾膜 過濾。（該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用）
[0143] 肝素酶溶液：根據(jù)肝素酶1、肝素酶2、肝素酶3的包裝，使用溶液A將其各自稀釋 至1. 2單位每毫升，按1:1:1混合均勻后分裝，-20°C以下凍存。
[0144] 依諾肝素鈉標準品溶液：精密稱取100毫克的賽諾菲克賽注射針溶液于潔凈離心 管中，加入900微升的超純水溶解，震蕩混勻，配制成20毫克每毫升的溶液，分裝-20°C凍 存。
[0145] 綿羊依諾肝素鈉溶液的配制：準確稱取實施例3樣品20毫克左右，按重以超純水 溶解成20毫克每毫升左右的濃度，震蕩混勻。
[0146] 流動相A:稱取364毫克的磷酸二氫鈉，溶于約900毫升的超純水中，用磷酸調(diào)節(jié) pH為3. 0,水定容到1000毫升，0. 22微米濾膜過濾。
[0147] 流動相B:稱取70克的一水合高氯酸鈉，溶于約400毫升的流動相A中，用磷酸調(diào) 節(jié)pH為3. 0,再以流動相A定容至500毫升，0. 22微米濾膜過濾。
[0148]b、綿羊依諾肝素鈉樣品和對照標準品的完全酶解：
[0149] 分別于不同離心管中一次加入20微升的依諾肝素鈉溶液、140微升的溶液B、40微 升的肝素酶1、2、3混合溶液，渦旋混勻，室溫酶解24小時。
[0150] 步驟（2):依諾肝素鈉酶解液的硼氫化鈉還原
[0151] 向上述步驟（l)b中的依諾肝素鈉酶解液加入32微升的溶液C，渦旋混勻，室溫下 還原4小時。再以0.45微米濾膜過濾于內(nèi)插管中。步驟（3):酶降解、還原產(chǎn)物的SAX-HPLC 分析
[0152] 色譜條件堿下表9,流動相梯度見表10。
[0153] 表9 :依諾肝素鈉樣品的SAX-HPLC分析條件