量高的厭氧培養(yǎng)液按10 1梯度稀釋，用涂布法接種于固 體分離培養(yǎng)基中在30°C、嚴格厭氧條件下培養(yǎng)5-7天。選取單個菌落繼續(xù)在相同條件下劃 線培養(yǎng)7天以進一步純化，反復多次，直到得到純菌株。然后挑選單菌落斜面保存，或接入 液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液用甘油保存在_80°C冰箱。
[0037] (2)菌種復篩
[0038] 將獲得的純菌株，再次接入以乳酸為碳源的液體培養(yǎng)基中，在30°C嚴格厭氧條件 下培養(yǎng)5-7天，觀察并驗證是否能夠轉(zhuǎn)化乳酸并產(chǎn)生己酸，復選出轉(zhuǎn)化速率快、己酸產(chǎn)量高 的菌株保存?zhèn)溆谩?br>[0039] (3)純菌檢測與驗證
[0040] 首先通過菌落形態(tài)、顏色和顯微鏡檢觀察細菌，初步判定是否是純菌株；然后通過 PCR擴增菌液的16srRNA基因序列，直接測序確定是否為純菌株。
[0041] 3、菌種培養(yǎng)
[0042] 挑取一環(huán)斜面菌種接入含上述培養(yǎng)基的厭氧管中，150rpm，，30°C培養(yǎng)3天，可獲 得濃度約10sCFU/mL的種子培養(yǎng)液。
[0043] 實施例二菌種的培養(yǎng)與鑒定
[0044] 1、形態(tài)特征
[0045] 菌落形態(tài)：梭菌CGMCCNo:9926在平板上培養(yǎng)7天后，菌落圓形，呈乳白色，光滑濕 潤，稍凸起，較粘稠，易挑取，菌落直徑1. 5mm。
[0046] 菌體形態(tài)：革蘭氏染色陽性，菌體呈球狀，直徑2.0-2. 5um。電鏡照片參見圖 1(SEM，5200X)
[0047] 2、生理生化特征
[0048] 用BiologANMicroPlates?和API20A厭氧鑒定系統(tǒng)分析得出該梭菌的生理生 化特征如表1。
[0049] 表1CPC-11的生理生化特征

[0052] 3、分子生物學特征
[0053] 采用細菌16SrRNA通用引物對27f-1492r擴增菌株CPC-11的16SrRNA，將擴增 約1500bp的目的片斷克隆到E.coliDH5a中，采用ABI3730測序儀測序。獲得CPC-11的 16SrRNA基因長度為 1325bp，參見SEQIDNo. 1。
[0054] 通過序列比對分析，該菌株與數(shù)據(jù)庫中的梭菌模式種（Clostridium sporosphaeroidesDSM1294) 94. 48 % 相似，與ClostridiumleptumDSM753 有 93. 27 % 相 似。根據(jù)細菌新種判定的重要標準（16SrRNA序列相似性〈97%)判斷CPC-11為瘤胃菌科 ClostridiumclusterIV(第IV簇）的一個新種。與CPC-11最相似的模式菌株如表2,基 于16SrRNA的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖2所示。
[0055] 表2與CPC-11最相似的模式菌株
[0056]
[0057]
[0058] 4、菌株的保藏
[0059] 將獲得的CPC-11(Clostridiumsp.CPC-11)純菌株，寄到中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研 究所，郵編100101)進行專利菌種保藏。保藏中心經(jīng)菌種復核與活性檢測后，于2014年11 月3日出具專利菌種保藏證書，編號CGMCCNo:9926。
[0060] 實施例三初始pH值對產(chǎn)己酸的影響試驗
[0061] 采用液體培養(yǎng)基（見實施例1)，加乳酸至終濃度為l〇g/L，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié) 培養(yǎng)基的酸堿度，得到初始pH分別為5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0共6個酸堿梯度，充N215 分鐘，然后分裝50mL于250ml厭氧瓶中，121°C滅菌15min。按5% (v/v)接種CPC-11菌液 (濃度約10sCFU/mL)，于30°C搖床150rppm振蕩培養(yǎng)7天，測定己酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。結(jié)果見 表3〇
[0062] 表3、不同pH對產(chǎn)己酸的影響
[0063]
[0064]
[0065] 由表可知，CPC-11在PH5. 0-6. 5范圍內(nèi)均能較好利用乳酸產(chǎn)己酸，最佳產(chǎn)己酸pH 為6. 0-6. 5,高于7. 0乳酸轉(zhuǎn)化基本停止，只能產(chǎn)生微量的己酸。
[0066] 實施例四底物對CPC-11產(chǎn)己酸的影響試驗
[0067] 以實施例1中培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制三種不同底物培養(yǎng)基如下，1#，乳酸 (10g/L) ;2#，乳酸（10g/L)和乙酸（2g/L) ;3#，乙醇（10g/L)和乙酸（2g/L)，充氮氣除氧 15min，滅菌后在厭氧操作箱接種5%的CPC-11菌液（濃度約10sCFU/mL)，在30°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)7天。結(jié)果如下：底物僅為乳酸的，己酸產(chǎn)量為3. 02g/L，;底物為乳酸加乙酸的己酸產(chǎn) 量為3. 53g/L，而底物為乙醇和乙酸的沒有己酸產(chǎn)生。說明CPC-11可以利用乳酸，或乳酸和 乙酸為底物合成己酸，其中添加乙酸可促進和加快乳酸的轉(zhuǎn)化。但該菌不能利用乙醇和乙 酸為底物產(chǎn)生己酸。表明該菌合成己酸的途徑是不同于以往以克氏梭菌為代表的微生物合 成己酸途徑（以乙醇和乙酸為底物合成己酸）。
[0068] 表4不同底物對CPC-11產(chǎn)己酸的影響
[0069]
[0070] 實施例四利用黃水發(fā)酵產(chǎn)己酸實驗
[0071] 將稀釋的黃水（乳酸濃度約40g/L)為發(fā)酵培養(yǎng)液，加入除氧劑半胱氨酸，再用氫 氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6. 0,通氮氣除氧，然后接種5 %的CPC-11種子液（濃度約10sCFU/mL)，在 半連續(xù)發(fā)酵反應器中厭氧培養(yǎng)，控制溫度30±2°C。以半連續(xù)的培養(yǎng)方式進行實驗，即當乳 酸降解完或即將降解完時，排出25%的發(fā)酵液，再加入等量的黃水，保證總反應體積不變。 通過液相色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)物。結(jié)果表明，從第3開始產(chǎn)丁酸，到第7天丁酸產(chǎn)量達21. 4g/ L，之后丁酸積累逐漸減少；己酸從第9天開始顯著增加，至第13天可達19g/L。
[0072] 本發(fā)明瘤胃菌科（Ruminococcaceae)新種Clostridiumsp.CPC-111 的 16SrRNA 序列（SEQIDNo. 1):

【主權(quán)項】
1. 瘤胃菌科（Ruminococcaceae)細菌新種，命名為Clostridiumsp.CPC-11，其模式株 的保藏號為CGMCCNo:9926。2. 權(quán)利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)細菌新種在用乳酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)己酸中 的用途。3. 權(quán)利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)細菌新種在發(fā)酵釀酒中的用途。4. 權(quán)利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)細菌新種在酒廠釀酒廢水處理中的 用途。5. 權(quán)利要求1所述的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)細菌新種在制備人工窖泥中的用 途。6. 包含權(quán)利要求1所述的細菌的菌劑。7. 包含權(quán)利要求1所述的細菌的窖泥。8. 包含權(quán)利要求7所述的窖泥的窖池。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的瘤胃梭菌CPC-11(Clostridium？sp.CPC-11)及其用途。本發(fā)明的提供的新的瘤胃梭菌Clostridium？sp.CPC-11能將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸，可利用乳酸或黃水發(fā)酵產(chǎn)己酸，同時可用于人工窖泥的強化培養(yǎng)或窖池發(fā)酵的“增已降乳”工藝，提高己酸產(chǎn)量，具有很好的應用前景。CGMCC No:992620141103
【IPC分類】C12R1/145, C02F3/34, C12P7/40, C12G3/02, C02F103/32, C12N1/20
【公開號】CN105420168
【申請?zhí)枴緾N201511025819
【發(fā)明人】徐姿靜, 陶勇, 徐占成, 何曉紅, 唐清蘭, 樊科權(quán)
【申請人】四川劍南春（集團）有限責任公司, 中國科學院成都生物研究所
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月30日