專利名稱：可以降解聚乳酸的菌株和其變種及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠降解聚乳酸的菌株和這些菌株的變種，并涉及其用途。
背景技術(shù)：
聚合物材料，通常也稱為“塑料”，由于其多價(jià)的物理化學(xué)性質(zhì)和其低生產(chǎn)成本而在許多領(lǐng)域中應(yīng)用。然而，其在最近數(shù)十年內(nèi)的密集應(yīng)用連同其抗降解性，目前已在與以下相關(guān)的廢物處理中造成主要問題截止2010，預(yù)計(jì)全世界消耗的塑料將達(dá)一億八千萬到兩億五千八百萬公噸。
盡管在廢物管理中付出相當(dāng)大的努力，如開發(fā)再循環(huán)回路，塑料的處理仍然造成許多問題，且焚化或垃圾掩埋法通常仍然是其最后消除的唯一的備選方案。最近幾年內(nèi)，新一代材料在市場(chǎng)上出現(xiàn)“可生物降解的”塑料(生態(tài)聚合物(ecopolymer)或生物塑料)。這是一系列相當(dāng)特別的材料，其制品適于其通過環(huán)境微生物處理和降解。不幸的是，市場(chǎng)上現(xiàn)有的生態(tài)聚合物僅在通常不是自然環(huán)境中存在的極端的有利條件下才是可降解的。生態(tài)聚合物中，聚乳酸(PLA)是最有前途的一種它是天然來源，且由于建立大規(guī)模生產(chǎn)而在過去幾年中具有商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)性。此外，其物理化學(xué)性質(zhì)可以允許其用于各種應(yīng)用。PLA被認(rèn)為既可生物降解又生物相容的，這尤其可以使用其來制備與活組織接觸的材料(即，用于生物醫(yī)學(xué)用途，如治療目的的分子的植入、縫合、包封等)。PLA合成是多步驟過程，其以乳酸生產(chǎn)開始，以單體聚合結(jié)束。由于基礎(chǔ)單體(乳酸)通過可再生資源(碳水化合物)的發(fā)酵獲得，全世界認(rèn)為PLA是未來“可持續(xù)發(fā)展”的材料。此外，盡管只有30%的工業(yè)可利用乳酸用于其生產(chǎn)，其在2006年的消耗為約60000公噸每年。因此這種聚合物具有相當(dāng)大的開發(fā)潛力。然而，盡管具有所有這些性質(zhì)，組成PLA的乳酸單體之間的酯鍵的穩(wěn)定性使得這種材料的可降解性降低。事實(shí)上，PLA僅在工業(yè)堆肥條件下在60°C或以上的溫度時(shí)才是完全可降解的。在該過程期間，PLA聚合物的降解是非生物降解(通過單體之間的酯鍵的簡(jiǎn)單水解，其在加熱條件下加速)和第二步驟中通過堆肥微生物的生物降解(其水解殘余低聚物直到最后的礦化步驟(整體構(gòu)成“生物”降解))的組合。因?yàn)椴捎眠@種溫度在能量方面是昂貴的，處理這種廢物的常規(guī)備選方案仍然是焚化或垃圾掩埋法，其從環(huán)境觀點(diǎn)而言特別有害。已經(jīng)預(yù)期采用純化微生物或酶來改進(jìn)PLA生物降解。以下研究報(bào)導(dǎo)了通過以下微生物降解低聚物(分子量約IOOODa):串珠鐮刀菌(Fusarium moniIiforme)和婁地干酪青霉菌(Penicillium roqueforti) (Torres, A 等，Screening of microorganismsfor biodegradation of poly(lactic-acid)and lactic acid-containing polymers,voI 62, 2393-2397);放線菌，如擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.) (Pranamuda, H.等，1997Polylactide Degradation by an Amycolatopsis sp, vol. 63,1637-1640);外外安德糖毛發(fā)菌(Saccharothrix waywayandensis) (Jarerat, A.,和 Tokiwa,Y. , 2003, BiotechnologyLetters 25,401-404);荒漠?dāng)M抱囊菌(Kibdelosporangium aridum) (Jarerat, A.等，2003, Biotechnology Letters 25,2035-2038)或細(xì)菌如短芽抱桿菌(Bacillus brevis)(Tomita, K.,1999, Journal of Bioscience and Bioengineering 87,752-755)或角軍淀粉類芽抱桿菌(Paenibacillus amylolyticus) (Teeraphatpornchai, T.等，2003,Biotechnology Letters 25,23-28)。其他研究描述了通過屬于葡萄球菌屬或?qū)儆阪溍咕鷮俚奈⑸锝到釶LA (US5 925 556和US 6 066 492)。此外，已經(jīng)證實(shí)通過酯酶類的酶(如德勒梅根霉屬Rhizopus deIemer的脂肪酶)降解低分子量PLA(約2000Da) (Fukuzaki,H. , 1989, European Polymer Journal 25,1019-1026)。隱球酵母 S2 酵母(Cryptococcussp. S2 yeast)的角質(zhì)酶樣酶也能水解 PLA(Masaki, K.,等人,2005, Cutinase-Like Enzymefrom the Yeast Cryptococcus sp. Strain S~2 Hydrolyzes Polylactic Acid andOtherBiodegradable Plastics 71,7548-7550)。
最后，研究表明某些商業(yè)脂肪酶，特別是來自產(chǎn)堿桿菌的脂肪酶PL，允許在20天內(nèi)完全降解PLA，但需要在特定溫度和pH條件下(55°C，pH 8. 5) (Hoshino, A.和Isono，Y. (2002))。脂族聚酯膜通過商售脂肪酶的降解可特別參考聚(L-丙交酯)膜通過來源于產(chǎn)堿桿菌的脂肪酶PL迅速且完全降解(Biodegradation 13,141-147)。以相同方式，已經(jīng)測(cè)試了商業(yè)蛋白酶的這種能力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中一些，特別是來源于桿菌屬的堿性蛋白酶，具體為Savinase 16. OL是有效的。然而，這些酶中沒有一個(gè)能夠降解工業(yè)PLA薄膜(由于實(shí)驗(yàn)薄膜具有無定形表面，它們比結(jié)構(gòu)更加結(jié)晶態(tài)的工業(yè)薄膜對(duì)降解更加敏感)(Oda，Y.等，2000, Degradation of Polylactide by Commercial Proteases. Journal of Polymersand the Environment 8,29-32)。最后,最常用于研究PLA生物降解的商業(yè)酶是白色念球菌(Tritirachium album)(Oda,Y.等，2000,Degradation of Polylactide by CommercialProteases. Journal of Polymers and the Environment 8,29-32)。然而，若干限制與這些方法有關(guān)，且它們中沒有一個(gè)是工業(yè)發(fā)展的主題。首先，在很多情況下，僅使用純化的酶才能觀察到明顯的PLA降解，這意味著通常與共同目的的用途不一致的非常高的生產(chǎn)成本和相對(duì)適中的增加值，例如園藝壺。第二點(diǎn)是所使用微生物大多數(shù)是實(shí)驗(yàn)室菌株，或從非常規(guī)環(huán)境中分離的菌株。因此，所描述的大多數(shù)酶活性處于自然環(huán)境中的亞最佳條件。最后，所測(cè)試的大多數(shù)微生物和酶僅能夠水解低分子量低聚物，這對(duì)于其用于使用大聚合物的工業(yè)過程是相當(dāng)大的限制。因此實(shí)際需要新的PLA降解手段。發(fā)明簡(jiǎn)述以其信譽(yù)，發(fā)明人已經(jīng)分離了屬于蒼白桿菌(Ochrobactrum)屬、具有令人驚訝的聚乳酸降解特性的菌株。因此，本發(fā)明的主題是蒼白桿菌屬菌株，其特征在于所述菌株能夠降解聚乳酸。本發(fā)明的主題也是根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2009年7月23日以法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心的名義以保藏號(hào)CNCM 1-4212保藏在法國(guó)國(guó)家微生物菌種保藏中心的蒼白桿菌屬菌株或所述菌株的變種，所述變種能夠降解聚乳酸。本發(fā)明也涉及微生物混合物，其特征在于其包含本發(fā)明菌株或所述菌株的變種。本發(fā)明的主題也是包含本發(fā)明菌株或所述菌株的變種或本發(fā)明微生物混合物的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)物為凍干粉末形式、含有所述凍干粉末和任選營(yíng)養(yǎng)素的片劑形式或水溶液形式。
本發(fā)明也涉及能降解聚乳酸的酶，其特征在于其由本發(fā)明菌株或所述菌株的變種產(chǎn)生。本發(fā)明也涉及本發(fā)明菌株或所述菌株的變種或本發(fā)明所述酶在降解聚乳酸中的用途。本發(fā)明也涉及聚乳酸降解方法，其特征在于其包括在于使需要降解的聚乳酸與本發(fā)明菌株或所述菌株的變種接觸，或與本發(fā)明能降解聚乳酸的酶接觸的步驟。定義根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“變種”是指-本發(fā)明菌株的天然變種，S卩，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)后由本發(fā)明菌株自發(fā)獲得的變種。因此，天然變種在沒有操縱子的任何遺傳操縱，且僅在合適的培養(yǎng)基中通過菌株的自然突變和該突變菌株的選擇而獲得，或-本發(fā)明菌株的變種，其基因組中含有至少一個(gè)突變，所述突變由遺傳工程誘導(dǎo)，例如通過位點(diǎn)-定向誘變或隨機(jī)誘變誘導(dǎo)。例如，所述隨機(jī)誘變可采用誘變劑例如輻射(UV射線、電離輻射、熱)或化合物(亞硝酸、甲烷磺酸乙酯、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、吖啶橙、原黃素等)。術(shù)語“突變”是指本發(fā)明菌株的基因組中至少一個(gè)核苷酸的增加、缺失或替換。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“ CE培養(yǎng)基”或“堆肥提取物”是指用于本發(fā)明細(xì)菌及其變種的培養(yǎng)基，其根據(jù)以下方法制備IL的CE培養(yǎng)基的制備方法將IOOg堆肥浸在適量的IL超純水(來自Mi 11 ipore的Mi 11 iQ系統(tǒng))，攪拌16h (過夜)。然后使混合物以4000g離心Ih,然后采用纖維過濾器(Whatman, 4級(jí)，孔20-25 μ m)
進(jìn)行澄清過濾。為了獲得固體(或“瓊脂”)CE培養(yǎng)基，可以以1.5% (w/v)的量添加瓊脂。然后使所述培養(yǎng)基在120°C (I巴)下高壓滅菌20分鐘。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“基本礦物培養(yǎng)基”是指用于本發(fā)明細(xì)菌及其變種的培養(yǎng)基，含有-10mg/L FeSO4. 7H20,-200mg/L MgSO4. 7H20,-lg/L (NH4)2SO4,-20mg/L CaCl2. 2H20,-100mg/L NaCl,-0. 5mg/L Na2MoO4. 2H20,-0. 5mg/L Na2WO4,-0. 5mg/L MnSO4,-100mg/L酵母提取物，-10. 7mM Tris-HCl,-pH 8-超純水(來自Millipore的MilliQ系統(tǒng))，適量
然后使所述培養(yǎng)基在120°C (I巴)下高壓滅菌20分鐘。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“ISP2培養(yǎng)基”是指用于本發(fā)明細(xì)菌及其變種的培養(yǎng)基，含有-酵母提取物4g/L，-麥芽提取物10g/L，-葡萄糖4g/L，-超純水(來自Millipore的MilliQ系統(tǒng))，適量然后使所述培養(yǎng)基在120°C (I巴)下高壓滅菌20分鐘。
發(fā)明詳述本發(fā)明的主題是蒼白桿菌屬菌株，其特征在于所述菌株能夠降解聚乳酸。本發(fā)明的主題尤其是根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2009年7月23日以法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心(3 rue Michel Ange, 75794 Paris Cedex 16)的名義以保藏號(hào)CNCM 1-4212保藏在法國(guó)國(guó)家微生物菌種保藏中心(CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du docteur Roux, F-75724Paris Cedex 15)的蒼白桿菌屬菌株或所述菌株的變種,所述變種能夠降解聚乳酸。事實(shí)上，發(fā)明人成功篩選并鑒定來自園林堆肥、能降解聚乳酸(PLA)的菌株。已經(jīng)可以將該菌株歸為蒼白桿菌屬，因此其被稱為蒼白桿菌37S(以保藏號(hào)CNCMI-4212保藏)。蒼白桿菌屬已經(jīng)由于多種不同污染的環(huán)境的生物修復(fù)特性而被分離菌株能夠降解溶劑，例如甲基叔丁基醚；芳族化合物，尤其是某些酚衍生物，如壬基酚或2，4，6-三溴酚；有機(jī)氯化化合物，如殺蟲劑硫丹等。此外，一些分離物顯示螯合重金屬和降低各種形式的鉻酸鹽和重鉻酸鹽、降解氯乙烯(塑料PVC基礎(chǔ)的單體)或產(chǎn)生可以增加烴生物降解的乳化胞外多糖的能力。然而，據(jù)發(fā)明人所知，沒有描述蒼白桿菌菌株能降解PLA的研究。本發(fā)明蒼白桿菌屬菌株的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是它們能夠降解簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中固體狀態(tài)和液體狀態(tài)下的高分子量PLA聚合物(通常為110000至120000Da)。而且，發(fā)明人證實(shí)了當(dāng)蒼白桿菌37S菌株(CNCMI-4212)在CE培養(yǎng)基(堆肥提取物)上培養(yǎng)時(shí)，其具有降解PLA的性質(zhì)，所述CE培養(yǎng)基通過簡(jiǎn)單地將堆肥浸在水中來制備。因此，所有這些觀察結(jié)果表明本發(fā)明蒼白桿菌屬菌株，尤其是蒼白桿菌37S菌株(CNCMI-4212)及其變種是針對(duì)特別在工業(yè)堆肥條件下改進(jìn)PLA降解的許多應(yīng)用的優(yōu)異候選者。本發(fā)明這些菌株及其變種降解聚乳酸的能力可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來評(píng)估。具體而言，本發(fā)明菌株及其變種降解聚乳酸的能力通?？梢酝ㄟ^包含以下步驟的測(cè)試A來評(píng)估I)用劃線法(streaking method),采用含有IO8到109CFU/mL的需要評(píng)估降解聚乳酸能力的所述菌株或所述變種的補(bǔ)充有l(wèi)g/L乳化聚乳酸的基本礦物瓊脂培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)物接種含有相同培養(yǎng)基的Petri培養(yǎng)皿，2)使在步驟⑴中接種的Petri培養(yǎng)皿在37°C下在濕潤(rùn)的孵育箱(86_88%濕度)中培養(yǎng)22天，和3)檢測(cè)Petri培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌落周圍透明區(qū)域的可能存在，所述透明區(qū)域顯示所測(cè)試的所述菌株或所述變種降解聚乳酸的能力。“劃線法”是本領(lǐng)域熟知的。它通常在于采用預(yù)先浸在細(xì)菌的液體培養(yǎng)物中的鉬環(huán)接種Petri培養(yǎng)皿，并在瓊脂培養(yǎng)基表面以來回移動(dòng)方式進(jìn)行劃線。
為了獲得用于本發(fā)明測(cè)試A的步驟I的補(bǔ)充聚乳酸的基本礦物培養(yǎng)基，將lg/L的分子量為110000至120000Da的聚乳酸在本發(fā)明基本礦物培養(yǎng)基中乳化。所述乳劑以下列方式制備首先將粉末形式的PLA(分子量為110000至120000Da的聚合物，Valagro,Poitiers, France)溶解在二氯甲烷中(50g/L的二氯甲烷)，然后以最終濃度為lg/L添加至目標(biāo)培養(yǎng)基中。然后通過采用Ultraturax 以最大速度在30到40秒將PLA分散在培養(yǎng)基中來勻化混合物。然后培養(yǎng)基立即進(jìn)行高壓滅菌(20分鐘，120°C，I巴)，以免形成聚集。最后，為獲得瓊脂培養(yǎng)基，將I. 5% (w/v)瓊脂加入所述補(bǔ)充有聚乳酸的基本礦物培養(yǎng)基中。然后將所述補(bǔ)充有l(wèi)g/L乳化聚乳酸的基本礦物培養(yǎng)基倒入Petri培養(yǎng)皿。
本發(fā)明也涉及微生物混合物，其特征在于其包含本發(fā)明菌株或所述菌株的變種。尤其是，所述微生物混合物可以包含具有降解聚乳酸特性的其他微生物。通常，這些微生物是細(xì)菌或真菌。更具體地,這些微生物可以選自屬于厚壁菌門(Firmus cutis)的細(xì)菌,其具有降解低分子量PLA聚合物(小于或等于20000Da)的特性,如Mayumi等所描述(Mayumi,D.等(2008), Applied Microbiology and Biotechnology 79,743-750)。細(xì)菌的其他實(shí)例是桿菌類細(xì)菌，尤其是臘樣芽胞桿菌菌株(Bacillus cereusspp.)或克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii spp.)。本發(fā)明菌株及其變種以及本發(fā)明微生物混合物通常以變化的形式制備。因此，本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明菌株或所述菌株的變種或本發(fā)明微生物混合物的產(chǎn)品(或組合物)，其特征在于所述產(chǎn)品(或組合物)為凍干粉末形式、含有所述凍干粉末和任選營(yíng)養(yǎng)素(例如維生素、礦物鹽等)的片劑形式或水溶液形式。通常，所述水溶液通過使至少一種本發(fā)明菌株或其變種或任選地本發(fā)明微生物混合物在合適的培養(yǎng)基，例如本發(fā)明基本礦物培養(yǎng)基或本發(fā)明CE培養(yǎng)基(堆肥提取物)中培養(yǎng)來獲得。本發(fā)明也涉及能降解聚乳酸的酶，其特征在于其由本發(fā)明菌株或所述菌株的變種產(chǎn)生。通常，該酶或PLA解聚酶可以通過克隆編碼所述酶的基因而鑒定。通過克隆鑒定所述酶尤其可以根據(jù)由Mayumi,D.等，2008, Applied Microbiology and Biotechnology 79,743-750中所述修改的方法來進(jìn)行。通常，通過克隆編碼所述酶的基因而鑒定所述酶包括以下步驟I)提取由在完全I(xiàn)SP2培養(yǎng)基中培養(yǎng)的蒼白桿菌37S菌株(以保藏號(hào)CNCMI-4212保藏)的培養(yǎng)物純化的DNA，然后采用Sau3AI酶部分消化；2)然后將獲得的2至4kb片斷預(yù)先用BamHI酶消化后克隆進(jìn)pUC18質(zhì)粒(Toyobo，Osaka, Japan)；3)將重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化而插入大腸桿菌DH5 α受體菌株；4)將40000個(gè)克隆的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5a細(xì)菌(統(tǒng)計(jì)學(xué)上覆蓋蒼白桿菌37S菌株的整個(gè)基因組)以每個(gè)培養(yǎng)皿約500個(gè)克隆的比例涂在含有用含有l(wèi)g/L乳化PLA (分子量為 110000至1200000&)的培養(yǎng)基和 I. 5%瓊脂(從Akutsu-Shigeno Y.等，2003，vol. 69，2498-2504調(diào)整的培養(yǎng)基)覆蓋的LB(Luria-Bertani)瓊脂培養(yǎng)基的Petri培養(yǎng)皿上；5)從在Petri培養(yǎng)皿上形成透明區(qū)域的細(xì)菌中提取質(zhì)粒；6)最終編碼所述酶(PLA解聚酶)的基因通過對(duì)插入物測(cè)序并與已知的酶序列(BLAST)比較來鑒定。
為幫助隨后的酶純化步驟，通常在克隆pET_24a(+)型的細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒(Novagen，Madison, USA)中的目標(biāo)基因后引入對(duì)應(yīng)于His.Tag 單元的標(biāo)簽。然后可在一步中通過使粗的酶提取物(轉(zhuǎn)化菌株超聲后獲得)通過鎳柱(Pharmacia, Biotech, Upsala, Sweden)而純化酶。然后如 Teeraphatpomchai 等(2003, Biotechnology Letters, 25, 23-28)所述通過測(cè)量PLA乳劑的濁度降低來測(cè)定從柱中洗脫的餾分的PLA解聚酶活性。然后合并顯示PLA解聚酶活性的組分,然后通過超速離心(YMlOmembranes ；Millipore, Bedford, USA)濃縮。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明菌株或所述菌株的變種或本發(fā)明所述酶在降解聚乳酸中的用途。本發(fā)明也涉及降解聚乳酸的方法，其特征在于其包括在于使需要降解的聚乳酸與本發(fā)明菌株或所述菌株的變種接觸，或與本發(fā)明能降解聚乳酸的酶接觸的步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述使需要降解的聚乳酸與本發(fā)明菌株或所述菌株的變種接觸的步驟在于用本發(fā)明菌株或所述菌株的變種接種所述需要降解的聚乳酸。因此本發(fā)明方法特別適于在含有聚乳酸的介質(zhì)或在含有完全或部分由聚乳酸組成的材料的介質(zhì)中降解聚乳酸，例如通常為家庭或工業(yè)廢物的混合物、有機(jī)廢物混合物，尤其是堆肥、液體肥料、活性污泥等。因此本發(fā)明用于降解聚乳酸的方法具有許多應(yīng)用，特別用于處理含有聚乳酸的廢物。而且，與常規(guī)焚化方法不同，本發(fā)明用于降解聚乳酸的方法具有不產(chǎn)生溫室氣體的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)是通過本發(fā)明細(xì)菌及其變種或通過本發(fā)明酶將PLA轉(zhuǎn)化為可收回的有機(jī)物質(zhì)，尤其是轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸。通常，本發(fā)明菌株或其變種降解的聚乳酸或PLA選自-L構(gòu)型乳酸的均聚物，-D構(gòu)型乳酸的均聚物，-L構(gòu)型乳酸和D構(gòu)型乳酸的共聚物，或-至少任何一種上述聚合物與另一種聚合物的共聚物，所述乳酸占所述共聚物組成的至少90重量％。更典型地，本發(fā)明菌株或其變種降解的聚乳酸或PLA也包含如上定義的完全或部分由聚乳酸組成的材料。根據(jù)本發(fā)明，部分由聚乳酸組成的材料通常是如上定義的部分由聚乳酸組成和部分由至少一種其他成分(例如特別是至少一種其他的生物塑料(生態(tài)聚合物)或非生物降解塑料)組成的材料。在一種具體實(shí)施方式
中，所述本發(fā)明菌株或其變種降解的聚乳酸是分子量小于140000Da，尤其為2000至HOOOODa的聚乳酸。更特別地，所述通過本發(fā)明菌株或其變種降解的聚乳酸的分子量為100000至130000Da，甚至更特別地為110000至120000Da。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將在以下實(shí)施例中描述，其應(yīng)認(rèn)為是作為例證而不限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式I. CNCM 1-4212 菌株的分離如下從園林堆肥中分離能降解PLA的菌株
-將一片PLA(85mmX 120mmX Imm ;分子量為 110 000 到 120 OOODa, Valagro,Poitiers,France)在簡(jiǎn)單的園林堆肥(Iteuil, Vienne d6partement [Vienne 縣],France)培養(yǎng)45天。然后通過采用金屬抹刀刮下在PLA片的表面上生長(zhǎng)的生物材料(生物薄膜)；-將IOOmg生物薄膜重懸于ImL磷酸鹽緩沖液(O.1M，pH 7)中。然后將250 μ L的所述懸浮液接種于包含如以下3. 2. 2段所述制備的lg/L的PLA(分子量為110000至120000Da的聚合物)乳劑的液體CE培養(yǎng)基。所得的預(yù)培養(yǎng)物在振搖下(200rpm)在37°C下培養(yǎng)3天；-然后所述CE液體培養(yǎng)基+PLA中菌株的富集(倍增)步驟通過在相同的條件下(振搖下在37°C下培養(yǎng)3天)在5mL相同培養(yǎng)基中的兩次連續(xù)的再接種(KT1稀釋度)來進(jìn)行；
-最后，移除最終培養(yǎng)物的等分試樣以獲得滅菌MilliQ水中稀釋度為10_5的懸浮液。然后將100 μ L的所述稀釋液涂在包含如以下3. I. 2段所描述制備的lg/L的PLA (分子量為110000至120000Da的聚合物)乳劑的CE瓊脂培養(yǎng)基中。然后將培養(yǎng)皿在37°C下在培育箱中培養(yǎng)22天。在該培養(yǎng)基中，分離被反映降解PLA的透明區(qū)域圍繞的菌落。將該菌株回收，重懸并采用劃線法涂在相同培養(yǎng)基中。2. CNCM 1-4212 菌株的鑒定首先在各種液體完全培養(yǎng)基中測(cè)試分離菌株(參見§ I.)的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，所述菌株在ISP2培養(yǎng)基(酵母提取物4g/L、麥芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L、純水適量)中強(qiáng)烈生長(zhǎng)。根據(jù) SchSfer和 Muyzer 所描述(ScMfer,，H. , and Muyzer, G. (2001)Methodsin Microbiology, Vol. 30, ed. J. H. Paul, London Academic Press, 425-468)從所述培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)物中提取總DNA。然后采用特異性引物(SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2)擴(kuò)增編碼16S RNA的一部分基因并測(cè)序。用于鑒定的引物序列如下(MuyzerG.等(1993), Appl. Environ. Microbiol. 59,695-700)34IF-GC (SEQ TD NO I)5，CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG3，和907R (SEQ ID NO 2)5’ CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3’將所獲得的序列與資料庫(kù)(Blast, ch.embnet.org)比較可以在產(chǎn)生系統(tǒng)演化樹后將菌株歸為蒼白桿菌屬。因此發(fā)明人用以下名稱表示CNCM 1-4212菌株蒼白桿菌37S。3.聚乳酸降解3. I.在瓊脂培養(yǎng)基中在補(bǔ)充有PLA的多種瓊脂培養(yǎng)基上測(cè)試CNCM 1-4212菌株降解分子量為110000至120000Da的聚乳酸的能力。3. I. I.補(bǔ)充分子量為110000至120000Da的聚乳酸的基本礦物瓊脂培養(yǎng)基為了獲得補(bǔ)充聚乳酸的所述基本礦物培養(yǎng)基，在本發(fā)明基本礦物培養(yǎng)基中乳化lg/L分子量為110000至120000Da的聚乳酸。所述乳劑以下列方式制備
首先將粉末形式的PLA(分子量為110000至120000Da的聚合物，Valagro,Poitiers,France)溶于二氯甲燒(50g/L的二氯甲燒)中，然后以最終濃度為lg/L添加至目標(biāo)培養(yǎng)基中。然后通過采用Ultraturax 以最大速度在30到40秒將pla分散在培養(yǎng)基中來勻化混合物。然后培養(yǎng)基立即進(jìn)行高壓滅菌(20分鐘，120°C，I巴)，以免形成聚集。最后，為獲得瓊脂培養(yǎng)基，將1.5% (w/v)瓊脂加入所述補(bǔ)充有聚乳酸的基本礦物培養(yǎng)基中。然后將所述補(bǔ)充有l(wèi)g/L乳化聚乳酸的基本礦物瓊脂培養(yǎng)基倒入Petri培養(yǎng)皿。
3. I. 2.補(bǔ)充分子量為110000至120000Da的聚乳酸的CE瓊脂培養(yǎng)基為了獲得補(bǔ)充有聚乳酸的所述CE培養(yǎng)基，如3. I. I.所描述在本發(fā)明CE培養(yǎng)基中乳化lg/L分子量為110000至120000Da的聚乳酸。為了獲得瓊脂培養(yǎng)基，將I. 5% (w/v)瓊脂加入所述補(bǔ)充有聚乳酸的所述CE培養(yǎng)基中，然后將其倒入Petri培養(yǎng)皿。3. I. 3.接種在如3. I. I.和3. I. 2.段所描述制備的Petri培養(yǎng)皿中通過劃線法采用含有IO8到109CFU/mL的CNCM 1-4212菌株的液體培養(yǎng)物(CE培養(yǎng)基或基本礦物培養(yǎng)基)接種。然后將培養(yǎng)皿在37 °C下在培育箱中培養(yǎng)22天。3. 1.4.觀察結(jié)果通過圍繞本發(fā)明菌株的菌落的清晰透明區(qū)域隨時(shí)間(接種后5到22天)的出現(xiàn)來評(píng)價(jià)PLA降解。培養(yǎng)22天后，不管所使用的培養(yǎng)基，本發(fā)明菌株的菌落被反映PLA降解的清晰透明區(qū)域包圍。然而，與在補(bǔ)充有聚乳酸的CE瓊脂培養(yǎng)基上所觀察到的相比較，在補(bǔ)充有聚乳酸的基本礦物瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)可以促進(jìn)PLA降解。3. 2.在液體培養(yǎng)基中還在液體培養(yǎng)基中評(píng)價(jià)CNCM 1-4212菌株降解分子量為110000至120000Da的聚乳酸的能力。3. 2. I.補(bǔ)充有分子量為110000至120000Da的聚乳酸的基本礦物液體培養(yǎng)基為了獲得補(bǔ)充有聚乳酸的CE液體培養(yǎng)基，如3. I. I.段所描述，在本發(fā)明CE培養(yǎng)基中乳化lg/L分子量為110000至120000Da的聚乳酸。3. 2. 3.接種在如3. 2. I和3. 2. 2段所描述制備的200mL CE培養(yǎng)基或基本礦物培養(yǎng)基中用大約5 X IO9CFU的CNCM 1-4212菌株接種或不接種(對(duì)照)，然后以150rpm振搖下在37°C下在培養(yǎng)30天。3. 2. 4.觀察結(jié)果一旦培養(yǎng)終止(D+30)，用二氯甲烷從培養(yǎng)基中萃取PLA。更具體地，將200mL 二氯甲烷添加至200mL培養(yǎng)物中。通過強(qiáng)烈攪拌獲得均勻相后，混合物傾析10分鐘，然后移除上相并將所述相轉(zhuǎn)移到IL玻璃燒杯中。溶劑完全蒸發(fā)后(通風(fēng)柜(Sorbonne)中放置3天)，通過燒杯中棕色沉淀的出現(xiàn)觀察剩余PLA(不降解)。結(jié)果表明，當(dāng)CNCM 1-4212菌株存在時(shí)，剩余PLA的沉淀明顯降低。不管什么培養(yǎng)基，均獲得相同結(jié)果。這些結(jié)果表明CNCM 1-4212菌株能夠降解液體狀態(tài)的高分子量PLA聚合物，尤其是在由堆肥提取物組成的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中，即CE培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的整個(gè)說明書提到現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)參考資料。這些參考資料的內(nèi)容以引用 方式合并入本發(fā)明說明書中。
權(quán)利要求
1.蒼白桿菌屬菌株，其特征在于所述菌株能夠降解聚乳酸。
2.根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2009年7月23日以法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心的名義以保藏號(hào)CNCM 1-4212保藏在法國(guó)國(guó)家微生物菌種保藏中心的蒼白桿菌屬菌株或所述菌株的變種，所述變種能夠降解聚乳酸。
3.微生物混合物，其特征在于其包含權(quán)利要求I或2所述的菌株或所述菌株的變種。
4.包含權(quán)利要求I或2所述的菌株或所述菌株的變種或權(quán)利要求3所述的微生物混合物的產(chǎn)品，其特征在于所述產(chǎn)品為凍干粉末形式、含有所述凍干粉末和任選營(yíng)養(yǎng)素的片劑形式或水溶液形式。
5.能降解聚乳酸的酶，其特征在于其由權(quán)利要求I或2所述的菌株或所述菌株的變種產(chǎn)生。
6.權(quán)利要求I或2所述的菌株或所述菌株的變種或權(quán)利要求5所述的酶在降解聚乳酸中的用途。
7.權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述聚乳酸的分子量小于140000Da。
8.降解聚乳酸的方法，其特征在于其包括在于使需要降解的聚乳酸與權(quán)利要求I或2所述的菌株或所述菌株的變種接觸，或與權(quán)利要求5所述的能降解聚乳酸的酶接觸的步驟。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述聚乳酸的分子量小于140000Da。
全文摘要
本發(fā)明涉及蒼白桿菌屬菌株，其可降解聚乳酸。本發(fā)明也涉及能降解聚乳酸的酶，其特征在于其由本發(fā)明所述菌株產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及能降解聚乳酸的所述菌株和所述酶的用途。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102639690SQ201080053453
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月2日
發(fā)明者T·費(fèi)雷拉, W·奧謝 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 普瓦捷大學(xué)