利用乳酸產(chǎn)己酸的瘤胃梭菌及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種新的瘤胃梭菌Clostridiumsp.CPC-11,以 及該菌在己酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 己酸（n-caproate)為含有六個碳原子的中鏈脂肪酸（C5HnC00H)，疏水性強(qiáng)，能量 密度高，是一種重要的化工原料，可用于食品香料、動物飼料、綠色抗菌劑和緩蝕劑生產(chǎn)等 領(lǐng)域。特別地，己酸是合成己酸乙酯（濃香型白酒品質(zhì)的主體香味物質(zhì)）的重要前體物。其 酯類產(chǎn)品還廣泛應(yīng)用于樹脂、橡膠、制藥等工業(yè)。
[0003] 微生物催化產(chǎn)己酸是一個碳鏈延長過程，研究最多和最為深入的是克氏梭菌 (Clostridiumklyuveri)，該菌通過乙醇氧化和逆β氧化途徑的結(jié)合，以乙醇為電子供體， 乙酸為電子受體合成己酸。目前普通認(rèn)為濃香白酒中己酸的產(chǎn)生也是以克氏梭菌為主的己 酸功能菌，通過上述途徑合成己酸；進(jìn)一步地，己酸與乙醇再通過酯化反應(yīng)生成濃香型白酒 的主體香成份一己酸乙酯。
[0004] 理論上，乳酸類似于乙醇，也是一種還原劑，應(yīng)可以為逆β氧化途徑提供乙酰輔 酶Α，從而進(jìn)行碳鏈延長合成中鏈脂肪酸，如己酸。但目前的研究表明，多數(shù)微生物以乳 酸為底物時，只能生成丁酸或丙酸，基本不產(chǎn)己酸或其他中鏈脂肪酸。僅有Megasphaera elsdeniiJ1據(jù)報道可以產(chǎn)生微量己酸（約23.2mg/L)。本領(lǐng)域急需開發(fā)將乳酸轉(zhuǎn)化為己 酸的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)難以將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸。本發(fā)明解 決技術(shù)問題的技術(shù)方案是一是提供一種瘤胃菌科（Ruminococcaceae)第4梭菌簇 (ClostridiumclusterIV)的一個新種，為Clostridiumsp.CPC-11，模式菌株的保藏號為 CGMCCNo：9926〇
[0006] 該新種的模式菌株已于2014年11月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵 編 100101)，保藏編號CGMCCNo:9926。
[0007] 同時，本發(fā)明提供了利用上述的瘤胃菌科細(xì)菌新種在用乳酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)己酸中的用 途。
[0008] 此外，本發(fā)明還提供了上述的瘤胃菌科細(xì)菌新種在發(fā)酵釀酒中的用途。
[0009] 同時，本發(fā)明提供了上述的的瘤胃菌科細(xì)菌新種在制備人工窖泥中的用途。
[0010] 此外，本發(fā)明也還提供了上述的瘤胃菌科細(xì)菌新種在酒廠釀酒廢水處理中的用 途。
[0011] 同時的，本發(fā)明也提供了一種菌劑，該菌劑包含上述的新種細(xì)菌。
[0012] 本發(fā)明也還提供了一種窖泥，該窖泥包含上述的新種細(xì)菌。同時也提供了包含上 述窖泥的窖池。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明的通過前期大量研究發(fā)現(xiàn)，以釀酒窖池中窖泥 為接種物，可將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸，表明窖泥中存在以乳酸為底物合成己酸的功能微生物及 己酸合成的新途徑。進(jìn)一步通過以乳酸為唯一碳源的培養(yǎng)基，從窖泥中采用梯度稀釋分離 獲得一乳酸利用型產(chǎn)己酸菌。該菌為嚴(yán)格厭氧梭菌，能夠顯著地利用乳酸產(chǎn)生己酸。
[0014] 該菌的菌落特征：
[0015] 本發(fā)明所述菌株在上述培養(yǎng)基固體平板上培養(yǎng)5天后，菌落圓形，呈乳白色，光滑 濕潤，稍凸起，較粘稠，易挑取。革蘭氏染色陽性。
[0016] 該菌的生理生化特征為：革蘭氏染色陽性，菌體的適宜生長溫度25-35 °C， pH5. 0-7. 0。可以利用的碳源主要有：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、蜜二糖、海藻糖、半乳 糖、蜜三糖、鼠李糖、L-乳酸和D-甘露糖等（詳見表1)等。不能利用的碳源主要有：乳糖、 甘露醇、木糖、阿拉伯糖、松三糖、乙酸、鼠李糖、D，L-乳酸、丙酸等（詳見表1)等。
[0017] 根據(jù)形態(tài)、生理生化、16SrDNA等特征，鑒定其應(yīng)為瘤胃菌科（Ruminococcaceae) 第 4 梭菌簇（ClostridiumclusterIV)的一個新種。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，由于乳酸在窖池積累影響風(fēng)味，本發(fā)明獲得的菌株可 應(yīng)用于窖池發(fā)酵，促進(jìn)乳酸轉(zhuǎn)化為己酸，降低乳酸含量，增加己酸含量，從而改善與提高白 酒的風(fēng)味與品質(zhì)。
[0019] 同時，本發(fā)明的細(xì)菌可用于新窖池（或新窖泥）的微生物強(qiáng)化改良，將新窖中過高 的乳酸快速轉(zhuǎn)化為己酸。因此可提高己酸，以及己酸乙酯的濃度，同時降低乳酸及乳酸乙酯 濃度過高對白酒風(fēng)味的不利影響，改善白酒的風(fēng)味和品質(zhì)。也就是說還可以用于人工窖泥 的制備。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，該菌還可用于黃水的綜合利用，即通過該菌的二次發(fā) 酵將黃水中乳酸進(jìn)一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化成己酸，同時減少廢水C0D排放。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于，提供了一種新的瘤胃菌科（Ruminococcaceae)細(xì)菌，該 菌具有高產(chǎn)己酸的特性及較好的生長穩(wěn)定性，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后可制備高濃度的強(qiáng)化產(chǎn)己酸菌 液，可用于利用乳酸或釀酒過程產(chǎn)生的黃水來發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)己酸，同時可用于人工窖泥的強(qiáng) 化培養(yǎng)或窖池發(fā)酵的"增已降乳"工藝，提高己酸產(chǎn)量，改善白酒的風(fēng)味和品質(zhì)，具有很好的 應(yīng)用前景。
[0022] 保藏說明
[0023]本發(fā)明涉及瘤胃菌科（Ruminococcaceae)第 4 梭菌族（ClostridiumclusterIV) 的一個新種，命名為Clostridiumsp.CPC-11。該新種的模式菌株已于2014年11月3日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號CGMCCNo:9926。
【附圖說明】
[0024] 圖1、細(xì)菌Clostridiumsp.CPC-11的掃描電鏡照片；
[0025] 圖2、細(xì)菌Clostridiumsp.CPC-11的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；
[0026]圖3、細(xì)菌Clostridiumsp.CPC-11的黃水發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例一菌種的分離、純化與培養(yǎng)
[0028] 1、用于分離和培養(yǎng)的培養(yǎng)基基
[0029] 培養(yǎng)基組成（每100mL):lg酪蛋白胨，0· 25g酵母汁，0· 4gNaHC03, 0·lg半胱氨 酸，0· 045gK2HP04, 0· 045gKH2P04, 0· 09gNaCl, 0· 009gMgS04 ·7Η20, 0· 009gCaCl2, 0·lmg刃 天青，lmg氧化血紅素，0. 5mL乳酸，微量元素溶液0.lml，維生素溶液lml。蒸餾水100ml。 其中：
[0030]微量元素溶（每L) :FeCl2. 4H20 1. 5g;CoCl2. 6H20 0· 19g;MnCl2. 4H20 0·lg; ZnCl2 0. 07g；NaM04. 2H20 0. 036g；NiCl2. 6H20 0. 024g；H3B03 0 . 006g；CuCl2. 2H20 0. 002g； HC1 (25%solution) 10ml.
[0031] 維生素溶液（每L) :p-氨基苯甲酸0· 04g;生物素0·Olg;煙酸0·lg;B5 0· 05g;B6 0· 15g辦0·lg;B12 0· 05g;D.L-硫辛酸0· 03g;B2 0· 03g;葉酸0· 01g。
[0032] 2、分離過程
[0033] (1)菌種的富集
[0034] 取窖泥l(xiāng)g，加入上述液體培養(yǎng)基，除氧，在30°C下振蕩厭氧培養(yǎng)5天后，用高效液 相色譜測定乳酸含量及代謝產(chǎn)物，選擇乳酸明顯降解的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)、富集，經(jīng)多次（5次以上）轉(zhuǎn)接富集，最終以乳酸徹底降解并產(chǎn)生己酸的培養(yǎng)液為目標(biāo)菌 種分離源。
[0035] (2)菌種的分離純化
[0036] 以生理鹽水，將產(chǎn)己酸含