牛源性成分鑒定及其制品中多物種種源成分的檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及牛源性成分鑒定及其制品中多物種種 源成分的檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國動物性食品的消費中，牛肉僅次于豬肉，其營養(yǎng)價值高，古有"牛肉補氣，功 同黃芪"之說。牛肉含有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸組成比豬肉更接近人體需要，而脂肪含量低， 故味道鮮美，享有"肉中驕子"的美稱。牛肉富含肌氨酸、維生素、肉毒堿、丙氨酸等營養(yǎng)成 分，鐵、鈣、鉀、鎂等微量元素含量豐富，且含有一種共輒亞油酸的脂肪酸，能夠減少脂肪沉 積，有減肥功效，因此牛肉產(chǎn)品受到越來越多消費者的青睞。
[0003] 隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展及生活水平的提高，人們對食物的要求也由此改變，從過去 追求數(shù)量上的滿足，轉(zhuǎn)向現(xiàn)在的講求美味營養(yǎng)、衛(wèi)生與安全。然而，肉制品行業(yè)涉及領(lǐng)域多， 產(chǎn)業(yè)鏈長，與農(nóng)業(yè)的關(guān)聯(lián)度強，與國際市場聯(lián)系緊密，其安全監(jiān)管則成為了一大難題，故肉 制品的安全性已成為消費者高度關(guān)注的社會問題。近年來，世界范圍內(nèi)的肉制品安全事件 頻頻發(fā)生，歐洲的"馬肉風(fēng)波"中，生產(chǎn)者用馬肉冒充高檔牛肉，嚴重損害消費者的利益。此 外，在飼料、皮張中動物源性成分摻假的現(xiàn)象也時有發(fā)生。因此，針對牛源性制品建立一套 科學(xué)、準確、快速、低廉的檢測方法是十分必要的。
[0004] 日常生活中人們通常依靠感官和經(jīng)驗進行動物產(chǎn)品鑒別，但是隨著加工方 法的改進和各類制品中摻假成分的多元化、種類的復(fù)雜化，這種方法已遠不能達到對 肉制品摻假現(xiàn)象進行控制與監(jiān)管的目的。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，以聚合酶鏈 式反應(yīng)（PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)已成為動物源性成分鑒定的核心方法。同時，DNA也因 其高穩(wěn)定性和在不同組織中的同一性被選作比蛋白質(zhì)更可靠的分析靶點。目前，根 據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計物種特異性引物所建立的PCR方法已有大量報 道(GhovvatiS,NassiriMR,MirhoseiniSZ,HeraviMA,JavadmaneshA.Fraud identificationinindustrialmeatproductsbymultiplexPCRassay.Food Control, 2009, 20 (8) :696-699；GirishPS,AnjaneyuluASR,ViswasKN,Shivakumar BM，AnandM，PatelM，SharmaB.Meatspeciesidentificationbypolymerasechain reaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)ofmitochondrial 12SrRNAgene.MeatScience, 2005, 70(1):107-112；DooleyJJ,PaineKE,GarrettS D,BrownΗM.DetectionofmeatspeciesusingTaqManreal-timePCRassays.Meat Science，2004, 68 (3) :431-438.)，且進入了中國權(quán)威的檢測技術(shù)標準（步迅，張全芳，劉 艷艷.一種同時鑒定山羊、綿羊、豬和鴨肉源性的熒光標記基因復(fù)合擴增方法[P]，中國 專利：CN103397101A，2013-11-20 ;張英杰，劉月琴，陳睿賾，劉彥琴，郭云霞，李雪梅，楊佳 棟，錫建中.一次性鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的PCR檢測方法及試劑盒[P]，中國專利： CN104099405A，2014-10-15.)。但是線粒體DNA拷貝數(shù)多，在不同組織中含量不同，穩(wěn)定 性差且難以進行定量分析。而動物細胞核基因組DNA序列具有高度的物種特異性，能夠 避免非特異性擴增，更加適合用作PCR定性和定量分析。目前，國際上以細胞核DNA序列 為目標序列，用于鑒別肉源的PCR檢測方法大多只能區(qū)分開牛、羊、豬、雞、鴨等常見肉制 品（黃明，程欣，楊靜，黃繼超，周興虎.一種快速檢測血旺中雞鴨豬血液成分的方法[P]， 中國專利：CN103525908A，2014-01-22;黃明，黃瑋玲，楊靜，徐幸蓮，周光宏.一種添加擴 增內(nèi)標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法[P]，中國專利： CN102864243B，2013-9-25)。而肉產(chǎn)品市場摻假的復(fù)雜性（例如，我國多地的"混合羊肉"事 件，不法分子將狐貍、水貂、鼠等動物肉，添加進羊肉里銷往江蘇、上海等地的農(nóng)貿(mào)市場；歐 洲"馬肉風(fēng)波"以馬肉冒充高檔牛肉等）表明，一種更加快速、簡便、準確、全面的肉類摻假 的檢測方法成為迫切的需求，而目前用于能同時鑒別馬、狐貍、水貂、鼠等動物源性成分的 PCR檢測方法尚未見報道。此外，在飼料、皮張中動物源性成分摻假的現(xiàn)象也時有發(fā)生。因 此，建立用于鑒別多物種的快速檢測方法對食品安全的監(jiān)管具有重要的實踐意義。
[0005] 此外，就檢測方法而言，目前多采用熒光PCR檢測（曹琛福，宗卉，張彩虹等.驢 或驢源性成分實時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針[P]，中國專利：CN102311999A， 2012-1-11 ;黃明，黃瑋玲，楊靜，徐幸蓮，周光宏.一種添加擴增內(nèi)標的食品中豬肉或雞肉 成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法[P]，中國專利：CN102864243B，2013-9-25)、 酶切檢測（章安，尤金花，解福生，師秀梅.一種鑒定動物皮張的方法[P]，中國專利： CN1294277C，2007-1-10 ;姚永剛，陳仕毅，劉益平.一種快速鑒別5種家畜肉和肉干制品種 類的方法[P]，中國專利：CN101712996,2010-5-26)或者通過擴增片段大?。▎探ㄜ?，孫艷 華，張智禹，關(guān)叢笑.多重PCR檢測食品中肉類來源的引物組及試劑盒[P]，中國專利：CN 101962675B，2013-2-6)等來進行判斷。但是熒光檢測方法對設(shè)備的要求高且花費較大； 酶切檢測方法則費時費力；而多重PCR通過擴增片段大小來鑒別動物種源嚴重限制了可檢 測物種的數(shù)量，且引物間常相互干擾或形成二聚體，影響檢測結(jié)果的可信度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種可用于牛源性制品特異性檢測的 引物；
[0007] 本發(fā)明的第二個目的在于提供用于牛源性制品檢測的檢測試劑盒；
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供牛源性制品摻假鑒定方法。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從種內(nèi)一致性和穩(wěn)定性、種間特異性、拷貝數(shù)等方面進行 ?；蚪M特異DNA序列的篩選，經(jīng)過牛科非牛亞科的綿羊、山羊，非?？频呢i、馬、驢、鼠（大 鼠、小鼠、倉鼠）、豚鼠、雞、鴨、鵝、兔、狗、狐、水貂和貉子等的基因組DNA及不同的牛品種 DNA中的檢測，篩選在牛中特異的、在其他物種中不存在或同源性低的DNA片段作為檢測分 子。經(jīng)過大量分析和實驗工作，最終獲得可供檢測使用的牛物種特異DNA序列，其核苷酸序 列如序列表SEQIDNo. 1所示。
[0010] 基于此，本發(fā)明首先提供一種牛特異性引物，其特異性擴增SEQIDNo. 1所示的核 苷酸序列或該序列的特異性片段。
[0011] 優(yōu)選地，引物長度為18~27bp。引物的設(shè)計需要考慮是否容易發(fā)生錯配、擴增片 段長度、反應(yīng)溫度等多方面。
[0012] 優(yōu)選地，該引物序列如下：
[0013] B0S_BUB-F: 5，-CAGACAAAGGTCAGGAAGTAATC-3，
[0014] B0S_BUB-R:5，-AGATGAGGGAAGAGCAGGTCTG-3，；
[0015] 或該引物向Y、3<端延伸或修飾得到的仍能特異性擴增SEQIDNo. 1所示序列 的引物。
[0016] 進一步，本發(fā)明提供含有上述特異性引物的檢測試劑盒。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒還進一步包括以下引物中的一種或多種：
[0018] (1)對豬基因組DNA進行擴增生成豬特異性擴增片段的引物對I:
[0021] (2)對馬屬（馬、驢）基因組DNA進行擴增生成馬屬特異性擴增片段的引物對II:
[0024] (3)對兔基因組DNA進行擴增生成兔特異性擴增片段的引物對III:
[0027] (4)對狐基因組DNA進行擴增生成狐特異性擴增片段的引物對IV:
[0030] (5)對狗基因組DNA進行擴增生成狗特異性擴增片段的引物對V:
[0033] (6)對水貂基因組DNA進行擴增生成水貂特異性擴增片段的引物對VI:
[0036] (7)對鼠（小鼠、大鼠、倉鼠）基因組DNA進行擴增生成鼠特異性擴增片段的引物 對W:
[0039] (8)對雞基因組DNA進行擴增生成雞特異性擴增片段的引物對W:
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