，細(xì)胞培養(yǎng)液不含有這些添加物中的至少I(mǎi)種的有效量。另外，在本發(fā)明的更優(yōu)選的方式中，細(xì)胞培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有這些添加物中的至少I(mǎi)種。另外，在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式中，細(xì)胞培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有添加物。因此，細(xì)胞培養(yǎng)液可以?xún)H含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0076]在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有血清。本說(shuō)明書(shū)中也有時(shí)將實(shí)質(zhì)上不含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稱(chēng)為“無(wú)血清培養(yǎng)基”。此處，“實(shí)質(zhì)上不含有血清”是指，培養(yǎng)液中的血清含量為在將細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)用于生物體時(shí)不造成不良影響的程度(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物中的血清白蛋白含量小于50ng的量)，優(yōu)選不主動(dòng)在培養(yǎng)液中添加這些物質(zhì)。本發(fā)明中，為避免移植時(shí)的副作用，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有異種血清，進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有非自身血清。
[0077]在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞培養(yǎng)液不含有有效量的生長(zhǎng)因子。此處，“有效量的生長(zhǎng)因子”是指與不存在生長(zhǎng)因子的情況相比顯著地促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子的量，或者，為了方便起見(jiàn)，指該技術(shù)領(lǐng)域中以細(xì)胞增殖為目的而通常添加的量。關(guān)于細(xì)胞增殖促進(jìn)的顯著性，例如，可以利用該技術(shù)領(lǐng)域中已知的任意統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(例如，t檢驗(yàn)等)適當(dāng)評(píng)價(jià)，另外，通常的添加量可以從該技術(shù)領(lǐng)域的各種已知文獻(xiàn)獲知。具體而言，骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)中的EGF的有效量為例如0.005 μ g/mL以上。
[0078]因此，“不含有有效量的生長(zhǎng)因子”是指，本發(fā)明的培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)因子的濃度小于上述有效量。例如，骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)中的EGF在培養(yǎng)液中的濃度優(yōu)選小于0.005 μ g/mL、更優(yōu)選小于0.001 μ g/mL。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)因子的濃度小于生物體中的通常濃度。該方式中，例如，骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)中的EGF在培養(yǎng)液中的濃度優(yōu)選小于5.5ng/mL，較優(yōu)選小于1.3ng/mL，更優(yōu)選小于0.5ng/mL。在更優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有生長(zhǎng)因子。此處，“實(shí)質(zhì)上不含有”是指，培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)因子的含量為將細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)用于生物體時(shí)不造成不良影響的程度，優(yōu)選不主動(dòng)在培養(yǎng)液中添加生長(zhǎng)因子。因此，該方式中，培養(yǎng)液中不含有濃度為其中的其他成分(例如血清等)中所含的濃度以上的生長(zhǎng)因子。
[0079]在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有留體藥物成分。此處，“留體藥物成分”是指具有留核的化合物中會(huì)對(duì)生物體造成腎上腺皮質(zhì)功能障礙、庫(kù)欣綜合征等不良影響的化合物。作為所述化合物，不受限制，例如，包括皮質(zhì)醇、潑尼松龍、去炎松、地塞米松、倍他米松等。因此，“實(shí)質(zhì)上不含有留體藥物成分”是指，培養(yǎng)液中的這些化合物的含量為將細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)用于生物體時(shí)不造成不良影響的程度，優(yōu)選不主動(dòng)在培養(yǎng)液中添加這些化合物，即，培養(yǎng)液中不含有濃度為其中的其他成分(例如血清等)中所含的濃度以上的甾體藥物成分。
[0080]在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)上不含有砸成分。此處，“砸成分”包含砸分子、及含砸化合物、特別是可以在生物體內(nèi)游離出砸分子的含砸化合物(例如，亞砸酸等)。因此，“實(shí)質(zhì)上不含有砸成分”是指，培養(yǎng)液中的這些物質(zhì)的含量為將細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)用于生物體時(shí)不造成不良影響的程度，優(yōu)選不主動(dòng)在培養(yǎng)液中添加這些物質(zhì)，即，培養(yǎng)液中不含有濃度為其中的其他成分(例如血清等)中所含的濃度以上的砸成分。具體而言，例如，為人的情況下，培養(yǎng)液中的砸濃度比人血清中的正常值(例如，10.6?17.4 μ g/dL)乘以培養(yǎng)基中所含的人血清的比例而得的值低(即，如果人血清的含量為10%，則砸濃度為例如1.0 ?小于 1.7 μ g/dL)。
[0081]在本發(fā)明的上述優(yōu)選方式中，不需要以往在制作應(yīng)用于生物體的細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)所必需的下述步驟:通過(guò)清洗等將生長(zhǎng)因子、留體藥物成分、異種血清成分等來(lái)自制造工序的雜質(zhì)除去的步驟。因此，本發(fā)明的方法的一個(gè)方式中不包括將該來(lái)自制造工序的雜質(zhì)除去的步驟。
[0082]此處，“來(lái)自制造工序的雜質(zhì)”典型地包含下文中列舉的來(lái)自各制造工序的物質(zhì)。即，為來(lái)自細(xì)胞基材的雜質(zhì)(例如，來(lái)自宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)、來(lái)自宿主細(xì)胞的DNA)、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)液的雜質(zhì)(例如，誘導(dǎo)劑、抗生素、培養(yǎng)基成分)、或來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)之后的工序(即，目標(biāo)物質(zhì)的提取、分離、加工、純化工序)的雜質(zhì)等(例如，參見(jiàn)日本醫(yī)藥審發(fā)第571號(hào))。
[0083]細(xì)胞的培養(yǎng)可以在該技術(shù)領(lǐng)域通常實(shí)施的條件下進(jìn)行。例如，作為典型的培養(yǎng)條件，可以舉出在37°(:、5%0)2下的培養(yǎng)。另外，培養(yǎng)可以在通常的氣壓(大氣壓)下進(jìn)行。從細(xì)胞培養(yǎng)物的充分形成、及防止細(xì)胞分化的觀點(diǎn)考慮，培養(yǎng)期間優(yōu)選為48小時(shí)以?xún)?nèi)、較優(yōu)選為40小時(shí)以?xún)?nèi)、更優(yōu)選為24小時(shí)以?xún)?nèi)。培養(yǎng)可以在任意大小及形狀的容器中進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)物的大小、形狀可以通過(guò)下述方法任意調(diào)節(jié):調(diào)整培養(yǎng)容器的細(xì)胞粘附面的大小.形狀，或在培養(yǎng)容器的細(xì)胞粘附面設(shè)置所期望的大小.形狀的?？?日文:型枠)、并在其內(nèi)部培養(yǎng)細(xì)胞等。
[0084]在本發(fā)明的制造方法的一個(gè)方式中，在將細(xì)胞解凍的步驟之后，在不使細(xì)胞實(shí)質(zhì)性增殖的情況下形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物。通過(guò)該步驟，可以進(jìn)一步提高片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的活性。
[0085]“不使細(xì)胞實(shí)質(zhì)性增殖”是指，不使細(xì)胞以超出計(jì)量誤差的范圍的程度增殖，關(guān)于細(xì)胞是否增殖，例如可以通過(guò)將接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)物形成后的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)。本發(fā)明中，對(duì)于片狀細(xì)胞培養(yǎng)物形成后的細(xì)胞數(shù)而言，典型地為接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)的300%以下，優(yōu)選為200%以下，較優(yōu)選為150%以下，更優(yōu)選為125%以下，特別優(yōu)選為100%以下。
[0086]細(xì)胞的增殖受到各種條件、例如接種細(xì)胞數(shù)(接種細(xì)胞密度)、培養(yǎng)環(huán)境(例如，培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等)、培養(yǎng)基的組成等的影響，因此，通過(guò)調(diào)節(jié)這些條件，可以不使細(xì)胞實(shí)質(zhì)性增殖。這些條件中，通過(guò)提高接種細(xì)胞密度，可以在抑制細(xì)胞的增殖的同時(shí)用較短時(shí)間獲得片狀細(xì)胞培養(yǎng)物，因此，本發(fā)明中優(yōu)選通過(guò)接種細(xì)胞密度來(lái)控制增殖。關(guān)于能夠在細(xì)胞不實(shí)質(zhì)性增殖的情況下形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的密度，如上文所述。
[0087]因此，本方式中，在將細(xì)胞解凍的步驟之后，不經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的細(xì)胞增殖步驟，在不使細(xì)胞實(shí)質(zhì)性增殖的條件下進(jìn)行片化培養(yǎng)。另外，本方式中，在將細(xì)胞解凍的步驟之后、到片化培養(yǎng)之前的期間，可以進(jìn)行不伴有細(xì)胞增殖的步驟、例如清洗細(xì)胞的步驟等。
[0088]對(duì)于本發(fā)明的制造方法而言，在形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟之后，可以還包括回收所形成的片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。關(guān)于片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的回收，只要片狀細(xì)胞培養(yǎng)物可以在至少部分地保持片結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下從作為支架(日文:足場(chǎng))的培養(yǎng)基材脫離(剝離)，則不受特別限制，例如，可以通過(guò)利用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶等)的酶處理及/或吹吸(pipetting)等機(jī)械性處理來(lái)進(jìn)行。另外，在利用響應(yīng)于刺激(例如，溫度、光)而發(fā)生物性變化的材料被覆表面而得的培養(yǎng)基材上培養(yǎng)細(xì)胞并形成細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，通過(guò)施加規(guī)定的刺激，也可以非酶性地脫離。
[0089]本發(fā)明的制造方法的一個(gè)方式，在形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟之后還包括回收片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟，并且，將細(xì)胞解凍的步驟在回收片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟前的48小時(shí)以?xún)?nèi)進(jìn)行。通過(guò)使將細(xì)胞解凍的步驟和回收片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟之間的時(shí)間為48小時(shí)以下、優(yōu)選為36小時(shí)以下、較優(yōu)選為24小時(shí)以下，可以進(jìn)一步提高片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的活性。
[0090]對(duì)于本發(fā)明的制造方法而言，在將細(xì)胞冷凍的步驟之前，可以還包括使細(xì)胞增殖的步驟。使細(xì)胞增殖的步驟可以通過(guò)已知的任意方法進(jìn)行，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適合于各種細(xì)胞的增殖的培養(yǎng)條件。本發(fā)明的制造方法中，在下述情形下，為了得到所期望的細(xì)胞數(shù)，在將細(xì)胞冷凍的步驟之前實(shí)施使細(xì)胞增殖的步驟是有用的，所述情形為:在將細(xì)胞解凍的步驟之后，在不使細(xì)胞實(shí)質(zhì)性增殖的情況下形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的情形；或在回收片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟前的48小時(shí)以?xún)?nèi)實(shí)施將細(xì)胞解凍的步驟的情形。
[0091]在一個(gè)方式中，本發(fā)明的制造方法不包括向細(xì)胞中導(dǎo)入基因的步驟。在另一方式中，本發(fā)明的制造方法包括向細(xì)胞中導(dǎo)入基因的步驟。關(guān)于導(dǎo)入的基因，只要是對(duì)作為對(duì)象的疾病的處理有用的基因，則不受特別限制，例如可以是HGF、VEGF等細(xì)胞因子。基因的導(dǎo)入可以使用磷酸I丐法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(lipofect1n method)、超聲波導(dǎo)入法、電穿孔法、基因槍法、利用腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等病毒載體的方法、顯微注射法等已知的任意方法實(shí)施。針對(duì)細(xì)胞的基因?qū)氩皇芟拗?，例如，可以在將?xì)胞冷凍的步驟之前進(jìn)行。
[0092]就通過(guò)本發(fā)明的制造方法得到的片狀細(xì)胞培養(yǎng)物而言，其活性高于通過(guò)除不包括將細(xì)胞冷凍的步驟和將冷凍的細(xì)胞解凍的步驟之外與本發(fā)明的制造方法相同的方法制造的片狀細(xì)胞培養(yǎng)物(以下，有時(shí)稱(chēng)為對(duì)照片狀細(xì)胞培養(yǎng)物)。作為所述活性，不受限制，例如可以舉出細(xì)胞因子產(chǎn)生能力、植入能力、血管誘導(dǎo)能力及組織再生能力等。此處，活性高是指，以對(duì)照片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的活性為基準(zhǔn)，活性高出例如5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上或100%以上，但不限于前述這些。
[0093]本發(fā)明中，細(xì)胞因子是指，從細(xì)胞釋放、介導(dǎo)各種細(xì)胞間相互作用的蛋白質(zhì)性因子。因此，本發(fā)明中的細(xì)胞因子并不限于從免疫細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子為有益于片狀細(xì)胞培養(yǎng)物向移植靶標(biāo)組織中的植入的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子為有益于血管新生的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子為有益于組織的再生的物質(zhì)。這樣的細(xì)胞因子在該技術(shù)領(lǐng)域中已為人所知，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于已知的信息確定合適的細(xì)胞因子。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子選自HGF及VEGF組成的組。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子產(chǎn)生能力為產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的能力。另外，在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞因子產(chǎn)生能力為產(chǎn)生選自HGF及VEGF組成的組中的生長(zhǎng)因子的能力。
[0094]片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的活性可以使用各種方法進(jìn)行定量化?；钚詾榧?xì)胞因子產(chǎn)生能力時(shí)，例如可以通過(guò)下述方法對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生能力進(jìn)行定量化:在培養(yǎng)液中以規(guī)定時(shí)間培養(yǎng)片狀細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)定被分泌至培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子的量，或測(cè)定在片狀細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的細(xì)胞因子基因的量等。測(cè)定特定蛋白質(zhì)的量、基因表達(dá)水平的方法在該技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，作為測(cè)定蛋白質(zhì)的量的方法，不受限制，例如可以舉出電泳法、Western印跡法、質(zhì)譜法、EIA、ELISA、RIA、免疫組織化學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)法等；作為測(cè)定基因表達(dá)水平的方法，不受限制，例如可以舉出Northern印跡法、Sourthern印跡法、DNA微陣列(DNAmicroarry)分析、RNA 酶保護(hù)試驗(yàn)(RNase protect1n assay)、RT-PCR、實(shí)時(shí)