源細(xì)胞(也稱為異體細(xì)胞)。自源細(xì)胞即使進(jìn)行移植也不發(fā)生排斥反應(yīng)，因此在本發(fā)明中是優(yōu)選的。但是，也可以利用源自異種的細(xì)胞、同種非自源細(xì)胞。利用源自異種的細(xì)胞、同種非自源細(xì)胞時(shí)，為了抑制排斥反應(yīng)，有時(shí)需要進(jìn)行免疫抑制處理。需要說明的是，本說明書中也有時(shí)將自源細(xì)胞以外的細(xì)胞、即源自異種的細(xì)胞和同種非自源細(xì)胞統(tǒng)稱為非自源細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞為自體細(xì)胞或異體細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，細(xì)胞為自體細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方式中，細(xì)胞為異體細(xì)胞。
[0046]本發(fā)明的制造方法中的將細(xì)胞冷凍的步驟可以利用已知的任意方法進(jìn)行。作為所述方法，可不受限制地舉出例如將容器內(nèi)的細(xì)胞供于冷凍手段(例如，冰箱、超低溫冰箱、低溫介質(zhì)(例如，液氮等))等。關(guān)于冷凍手段的溫度，只要為能夠使容器內(nèi)的細(xì)胞群的一部分(優(yōu)選為細(xì)胞群整體)冷凍的溫度，則不受特別限制，典型的溫度為0°C以下，優(yōu)選為一20°C以下，更優(yōu)選為一 40°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選為一 80°C以下。另外，關(guān)于冷凍操作中的冷卻速度，只要不嚴(yán)重?fù)p害冷凍解凍后的細(xì)胞的存活率、功能，則不受特別限制，典型地，為如下程度的冷卻速度:從4°C開始冷卻，直至達(dá)到一 80°C為止，歷經(jīng)I?5小時(shí)、優(yōu)選為2?4小時(shí)、特別優(yōu)選為約3小時(shí)。具體而言，例如，可以以0.46°C /分鐘的速度進(jìn)行冷卻。通過將含有細(xì)胞的容器直接供于或收容于冷凍處理容器中后供于設(shè)定為所期望的溫度的冷凍手段，可以實(shí)現(xiàn)上述冷卻速度。冷凍處理容器也可以具有將容器內(nèi)的溫度的下降速度控制為規(guī)定的速度的功能。作為上述冷凍處理容器，可以使用已知的任意容器，例如，BICELLw (NihonFreezer C0., Ltd.)等。
[0047]關(guān)于冷凍操作，可以在將細(xì)胞浸漬于培養(yǎng)液、生理緩沖液等中的狀態(tài)下進(jìn)行，也可以在實(shí)施了向培養(yǎng)液中添加冷凍保護(hù)劑(其用于保護(hù)細(xì)胞免受冷凍.解凍操作的損傷)、或?qū)⑴囵B(yǎng)液置換為含有冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液等的處理之后進(jìn)行。因此，本發(fā)明的制造方法也可以還包括向培養(yǎng)液中添加冷凍保護(hù)劑的步驟、或?qū)⑴囵B(yǎng)液置換為冷凍保存液的步驟。將培養(yǎng)液置換為冷凍保存液時(shí)，如果在冷凍時(shí)浸漬有細(xì)胞的液體中含有有效濃度的冷凍保護(hù)劑，則既可以在將培養(yǎng)液實(shí)質(zhì)性地全部除去后添加冷凍保存液，也可以在殘留有一部分培養(yǎng)液的狀態(tài)下添加冷凍保存液。此處，“有效濃度”是指冷凍保護(hù)劑顯示出冷凍保護(hù)效果(例如，與不使用冷凍保護(hù)劑時(shí)相比，抑制冷凍解凍后的細(xì)胞的存活率、活力、功能等的降低的效果)而不顯示毒性的濃度。所述濃度為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的濃度，或者可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)等適當(dāng)確定。
[0048]關(guān)于用于本發(fā)明的制造方法的冷凍保護(hù)劑，只要是對細(xì)胞顯示出冷凍保護(hù)作用的物質(zhì)，則不受特別限制，例如，包括二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、絲膠蛋白、丙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥乙基淀粉、硫酸軟骨素、聚乙二醇、甲酰胺、乙酰胺、核糖醇、鱷梨糖醇(perseitol)、棉子糖(raffinose)、乳糖、海藻糖、鹿糖、甘露糖醇等。冷凍保護(hù)劑可以單獨(dú)使用，也可以組合使用2種或3種以上。
[0049]關(guān)于冷凍保護(hù)劑在培養(yǎng)液中的添加濃度、或冷凍保存液中的冷凍保護(hù)劑的濃度，只要為上文中定義的有效濃度則不受特別限制，典型地，例如相對于培養(yǎng)液或冷凍保存液總體為2?20% (ν/ν) ο但是，也可以采用雖不在上述濃度范圍內(nèi)、但就各種冷凍保護(hù)劑而言為已知的或經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的替代性使用濃度，上述濃度也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0050]本發(fā)明的制造方法中的將冷凍的細(xì)胞解凍的步驟可以利用已知的任意細(xì)胞解凍方法實(shí)施，典型地，例如可通過對冷凍的細(xì)胞進(jìn)行解凍手段(例如，溫度比冷凍溫度高的固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)的介質(zhì)(例如，水)、水浴、孵育器(incubator)、恒溫器等)、或?qū)⒗鋬龅募?xì)胞浸漬在溫度比冷凍溫度高的介質(zhì)(例如，培養(yǎng)液)中而實(shí)現(xiàn)，但并不限于此。關(guān)于解凍手段或浸漬介質(zhì)的溫度，只要是能夠在所期望的時(shí)間內(nèi)將細(xì)胞解凍的溫度，則不受特別限制，典型的溫度為4?50°C、優(yōu)選為30°C?40°C、更優(yōu)選為36?38°C。另外，關(guān)于解凍時(shí)間，只要不嚴(yán)重?fù)p害解凍后的細(xì)胞的存活率、功能，則不受特別限制，典型的解凍時(shí)間為2分鐘以內(nèi)，尤其是通過使解凍時(shí)間為20秒以內(nèi)，可以大幅抑制存活率的降低。解凍時(shí)間例如可以通過改變解凍手段或浸漬介質(zhì)的溫度、冷凍時(shí)的培養(yǎng)液或冷凍保存液的容量或組成等來進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0051 ] 就本發(fā)明的制造方法而言，在將冷凍的細(xì)胞解凍的步驟之后、且在形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟之前，可以包括清洗細(xì)胞的步驟。細(xì)胞的清洗可以利用已知的任意方法進(jìn)行，典型地，例如可通過將細(xì)胞懸浮于液體(例如，含有或不含有血清、血清成分(血清白蛋白等)的培養(yǎng)液或生理緩沖液等)中、進(jìn)行離心分離、棄置上清液并回收已沉淀的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)，但并不限于此。在清洗細(xì)胞的步驟中，上述懸浮、離心分離、回收的循環(huán)可以實(shí)施I次或多次(例如，2、3、4、5次等)。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，清洗細(xì)胞的步驟在進(jìn)行將冷凍的細(xì)胞解凍的步驟之后立即進(jìn)行。
[0052]本發(fā)明的制造方法中的形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟可以利用已知的任意方法進(jìn)行。作為所述方法，可不受限制地舉出例如專利文獻(xiàn)I中記載的方法。形成片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟可以包括將細(xì)胞接種至培養(yǎng)基材上的步驟、及使接種的細(xì)胞片化的步驟。
[0053]對于培養(yǎng)基材而言，只要細(xì)胞能在其上形成細(xì)胞培養(yǎng)物，則不受特別限制，例如，包括各種材質(zhì)的容器、容器中的固態(tài)或半固態(tài)的表面等。容器優(yōu)選為不使培養(yǎng)液等液體透過的結(jié)構(gòu).材料。作為所述材料，不受限制，例如可以舉出聚乙稀、聚丙烯、Teflon(注冊商標(biāo))、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龍6，6、聚乙烯醇、纖維素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、金屬(例如，鐵、不銹鋼、招、銅、黃銅)等。另外，容器優(yōu)選具有至少I個(gè)平坦的面。作為所述容器的例子，不受限制，例如可以舉出細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。另外，容器可以在其內(nèi)部具有固態(tài)或半固態(tài)的表面。作為固態(tài)的表面，可以舉出如上所述的各種材料的板、容器等，作為半固態(tài)的表面，可以舉出凝膠、軟質(zhì)的聚合物基質(zhì)等。培養(yǎng)基材可以使用上述材料來制作，也可以利用市售的培養(yǎng)基材。作為優(yōu)選的培養(yǎng)基材，不受限制，例如可以舉出適于片狀細(xì)胞培養(yǎng)物的形成的、具有粘附性表面的基材。具體而言，可以舉出具有親水性表面的基材，例如，在該表面上涂布有經(jīng)電暈放電處理的聚苯乙稀、膠原凝膠(collagen gel)、親水性聚合物等親水性化合物的基材；另外，還可以舉出表面涂布有膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白(Iaminin)、玻連蛋白(tronectin)、蛋白多糖(proteoglycan)、糖胺多糖(glycosaminoglycan)等胞外基質(zhì)、|丐黏著蛋白家族(cadherinfamily)、選擇素家族(seletin family)、整合素家族(integrin family)等細(xì)胞粘附因子等的基材等。另外，上述基材已有市售(例如，CorningwTC處理培養(yǎng)皿(TC-TreatedCulture Dish)、Corning 等)。
[0054]培養(yǎng)基材可以在表面被覆有響應(yīng)于刺激(例如，溫度、光)而發(fā)生物性變化的材料。作為所述材料，不受限制，例如可以使用下述已知材料:由(甲基)丙烯酰胺化合物、N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氫糠基丙烯酰胺、N-四氫糠基甲基丙烯酰胺等)、N，N- 二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N, N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N, N-甲基乙基丙烯酰胺、N, N- 二乙基丙烯酰胺等)、具有環(huán)狀基團(tuán)的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，1-(1-氧代-2-丙烯基)_吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-嗎啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)_吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-嗎啉等)、或乙烯基醚衍生物(例如，甲基乙烯基醚)的均聚物或共聚物形成的溫度響應(yīng)性材料，具有偶氮苯基的光吸收性高分子、三苯甲燒無色氫氧化物(triphenylmethaneIeucohydroxide)的乙稀基衍生物與丙稀酰胺系單體的共聚物、及含有螺苯并卩此喃的N-異丙基丙烯酰胺凝膠等光響應(yīng)性材料等(例如，參見日本特開平2-211865、日本特開2003-33177)。通過對這些材料施加規(guī)定的刺激，可以使其物性(例如，親水性、疏水性)變化，從而促進(jìn)粘附在該材料上的細(xì)胞培養(yǎng)物的剝離。被覆有溫度響應(yīng)性材料的培養(yǎng)皿已有市售(例如，CellSeed Inc.的UpCellw)，可以將其用于本發(fā)明的制造方法中。
[0055]上述培養(yǎng)基材可以為各種形狀，但優(yōu)選為平坦的。另外，其面積不受特別限制，典型的面積為I?200cm2，優(yōu)選為2?100cm2，更優(yōu)選為3?50cm2。
[0056]培養(yǎng)基材可以涂覆(被覆或涂布)有血清。通過使用涂覆有血清的培養(yǎng)基材，可以形成密度更高的片狀細(xì)胞培養(yǎng)物。所謂“涂覆有血清”，是指在培養(yǎng)基材的表面粘附有血清成分的狀態(tài)。所述狀態(tài)不受限制，例如，可以通過用血清對培養(yǎng)基材進(jìn)行處理而獲得。利用血清的處理包括使血清與培養(yǎng)基材接觸、及根據(jù)需要孵育規(guī)定的時(shí)間。作為血清，可以使用異種血清及同種血清。關(guān)于異種血清，在將細(xì)胞培養(yǎng)物用于移植的情況下，其表示來自與受體為不同的種的生物的血清。例如，受體為人時(shí)，來自牛、馬的血清(例如，胎牛血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、馬血清(HS))等屬于異種血清。另外，“同種血清”是指來自與受體為相同的種的生物的血清。例如，受體為人時(shí)，人血清即為同種血清。同種血清包括自身血清(也稱為自體血清，即，來自受體的血清)、及來自受體以外的同種個(gè)體的同種異體血清。需要說明的是，在本說明書中，也有時(shí)將自身血清以外的血清(即，異種血清和同種異體血清)統(tǒng)稱為非自身血清。
[0057]關(guān)于用以涂覆培養(yǎng)基材的血清，可以為市售的血清，或通過常規(guī)方法從采自所期望的生物的血液進(jìn)行制備。具體而言，例如可以舉出下述方法，即，將采集的血液于室溫下放置20?60分鐘左右從而使其凝固，將其在1000?1200 Xg左右的條件下離心分離，并米集上清液的方法等。
[0058]在培養(yǎng)基材上進(jìn)行孵育時(shí)，血清可以使用原液，也可以稀釋后使用。稀釋可以使用任意介質(zhì)進(jìn)行，例如，可以不受限制地使用水、生理鹽水、各種緩沖液(例如，PBS, HBS等)、各種液體培養(yǎng)基(例如，DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB (MCDB102、104、107、