具有抗氧化能力、促進(jìn)肉雞生長發(fā)育的解淀粉芽胞桿菌tl的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用微生物添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株抗氧化能力強(qiáng)、促進(jìn)肉雞 生長發(fā)育的解淀粉芽胞桿菌度acillusAmyloliquefaciens)TL的篩選及應(yīng)用。本發(fā)明與 抗生素添加劑應(yīng)用領(lǐng)域有關(guān)，設(shè)及一株飼用豬源益生解淀粉芽胞桿菌菌株的分離鑒定、安 全性評(píng)價(jià)、抗逆性能及益生性能鑒定及作為畜禽用飼料添加劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中，抗生素W其在防治動(dòng)物疾病，提升畜禽生產(chǎn)性能等方面的優(yōu) 勢(shì)而得W廣泛應(yīng)用，因此在一定程度上使養(yǎng)殖業(yè)從散養(yǎng)型更有效地轉(zhuǎn)向了集約化、規(guī)模化， 從而帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。然而近些年來，由于抗生素大量及不正當(dāng)?shù)氖褂?，其帶來的問題 也接遲而至，如耐藥菌株的大量產(chǎn)生、動(dòng)物正常菌群失調(diào)、畜產(chǎn)品中藥物殘留等，運(yùn)都嚴(yán)重 制約著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時(shí)還影響人類健康，已引起各界人±的高度重視。目前，在世界各 國對(duì)畜禽用抗生素均有嚴(yán)格限制，而今后禁用抗生素添加劑也定是必然趨勢(shì)。在當(dāng)前的養(yǎng) 殖環(huán)境下，如何走出因抗生素限用禁用而給養(yǎng)殖業(yè)帶來的困境，尋求一種既無毒、無殘留、 無抗藥性，又能防病、促生長的飼用添加劑是關(guān)鍵，而益生菌一一具備上述優(yōu)勢(shì)，因此被認(rèn) 為事抗生素最有效的替代品之一。
[0003] 解淀粉芽胞桿菌為芽胞桿菌屬，是一種與枯草芽胞桿菌親緣性很高的細(xì)菌，其在 生長過程中可W產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物。是存在于人類和動(dòng)物腸道 內(nèi)的有益菌，可形成芽胞，能耐高溫、耐酸、耐膽汁，耐多種抗生素，在通過消化道時(shí)不失活， 在體外能穩(wěn)定保存。解淀粉芽胞桿菌可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，可代謝 產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，包括多膚類、脂膚類及抑菌蛋白類等。因此，其作為飼料添加劑，與其他微生 物飼料添加劑相比具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
[0004]目前，國內(nèi)外研究人員對(duì)環(huán)境中分離鑒定得到不同的解淀粉芽胞桿菌菌株及其代 謝產(chǎn)物的相關(guān)報(bào)道較多，結(jié)果表明解淀粉芽胞桿菌對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌有良好的抑制效 果。也有從動(dòng)物糞便及腸道內(nèi)容物中分離得到的解淀粉芽胞桿菌，并將其作為益生菌添加 劑添加到飼糧中用于動(dòng)物生產(chǎn)，有較好抑制致病菌的效果，可明顯提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。解淀 粉芽胞桿菌作為添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景，有望作為益生菌制劑在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng) 用。然而，關(guān)于其促生長方面的報(bào)道并不多，本發(fā)明將就解淀粉芽胞桿菌化促進(jìn)肉雞生長 發(fā)育，展開一系列的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株安全、抗氧化能力強(qiáng)、抗病性能強(qiáng)、特別是能明顯促進(jìn)畜 禽（例如促進(jìn)肉雞生長發(fā)育）生長發(fā)育的可用做微生物飼料添加劑的解淀粉芽胞桿菌。
[0006] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 根據(jù)篩選目標(biāo)和益生菌的生理生化特性及遺傳學(xué)特性，本發(fā)明W經(jīng)典的生理生化 手段及現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，從健康豬的直腸內(nèi)容物中，經(jīng)過大量分選，從湖北省武漢市 某豬場(chǎng)飼養(yǎng)的健康豬的腸道的內(nèi)容物中分離篩選得到一株具有抗氧化能力強(qiáng)、能促進(jìn)肉 雞生長發(fā)育的解淀粉芽胞桿菌菌株，申請(qǐng)人將該菌株命名為解淀粉芽胞桿菌化，Bacillus Amyloliquefaciens化，于2015年6月4日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、（CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCCNO:M2015359。
[0008]本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌化的菌學(xué)特性：
[0009] 解淀粉芽胞桿菌化為兼性厭氧的革蘭氏陽性芽抱桿菌，在LB平板上生長時(shí)成 乳白色圓形或近似圓形菌落，不透明，邊緣不規(guī)則，中央隆起，表面有皺權(quán)。菌體呈桿狀， 芽胞近似楠圓型，位于菌體中央或稍偏。最適生長溫度范圍為28°C~30°C;最適生長酸 堿度范圍為抑6. 5~7.0。該菌株生理生化特性符合《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》上關(guān)于解淀粉 芽胞桿菌的描述。將其16SrRNA基因進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序，結(jié)果在NCBI進(jìn)行Blastn比 對(duì)，發(fā)現(xiàn)其16SrRNA與解淀粉芽胞桿菌、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌等芽胞桿菌 的16SrRNA序列同源性均達(dá)到99%W上，同時(shí)將其gy巧基因進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序，進(jìn)行 Blastn比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株與解淀粉芽胞桿菌同源性最高，確定為解淀粉芽胞桿菌度acillus Amyloliquefaciens)〇
[0010] 該菌株在酸性和高膽鹽環(huán)境中的生存能力強(qiáng)，在抑3. 0條件下解育化，活菌數(shù)仍 在同一數(shù)量級(jí)，均在IO8CFlVmU存活率達(dá)到67. 19%，可耐受0. 5%膽鹽12h。由此推測(cè)，該 菌株能夠抵抗胃酸和小腸中高濃度膽鹽的不利影響，粘附于腸道存活下來發(fā)揮益生作用， 運(yùn)在動(dòng)物試驗(yàn)中也得到證實(shí)。
[0011] 該菌株能產(chǎn)芽胞，對(duì)高溫的耐受能力相對(duì)較強(qiáng)。80°c和90°C下，處理時(shí)間分別設(shè)為 10min，20min，30min。80°C水浴中，隨著時(shí)間的延長，活菌數(shù)緩慢下降，但仍在同一數(shù)量級(jí)， 達(dá)到1〇8,其最低存活率仍達(dá)到59.25% ;90°C水浴中，隨著水浴時(shí)間的延長，活菌數(shù)下降，但 仍在同一數(shù)量級(jí)，達(dá)到1〇8,其最低存活率達(dá)到在50. 00%。表明該菌株可W耐受飼料熟化 和制粒的高溫，為其作飼料添加劑的應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際奠定了良好基礎(chǔ)。
[0012] 對(duì)該菌株的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠體征正常，未出現(xiàn)中毒和死亡現(xiàn) 象。運(yùn)與后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，確保了其作為飼料添加劑應(yīng)用的安全性。
[0013] 該菌株對(duì)常見腸道致病菌（金黃色萄萄球菌、大腸桿菌、沙口氏菌、單增李斯特 菌）均有明顯的抑菌作用。運(yùn)與后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明了該菌株有增強(qiáng)抵抗力的 功效。
[0014] 該菌株對(duì)常用獸藥如青霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、壯觀霉素、萬古 霉素、環(huán)丙沙星、諾氣沙星、氨節(jié)西林和巧喃妥因均敏感，運(yùn)對(duì)該菌株與抗生素的配伍使用 提供了依據(jù)。
[0015]申請(qǐng)人將本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌化通過液體發(fā)酵按常規(guī)離屯、噴霧干燥制成微 生態(tài)制劑（或稱菌劑），應(yīng)用于飼料添加劑，進(jìn)行了肉雞飼喂試驗(yàn)W研究其益生特性，結(jié)果 表明，對(duì)肉雞有降低料肉比，促進(jìn)生長的作用，試驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的效果，從而完成了本發(fā)明 的任務(wù)。
[0016] 本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌化具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] (1)解淀粉芽胞桿菌化來源于健康豬的腸道的內(nèi)容物，從大量候選菌株中分離和 篩選得到，對(duì)常見腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙口氏菌、單增李斯特菌等具 有明顯的抑菌效果。完全耐受胃酸及腸道膽鹽高滲透壓環(huán)境，因此可在腸道中發(fā)揮益生作 用。同時(shí)該菌株能產(chǎn)芽抱，抗逆性強(qiáng)。
[001引 似動(dòng)物試驗(yàn)證明，解淀粉芽胞桿菌化可作畜禽飼料添加劑使用，對(duì)畜禽腸道致 病菌有抑制作用，可促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育、提高機(jī)體的抗氧化能力，達(dá)到明顯提高畜禽 生產(chǎn)性能的效果，并為其在飼料中的添加量提供參考。
[0019] 更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方案》的內(nèi)容。
【附圖說明】
[0020] 序列表SEQIDNO: 1是本發(fā)明分離株解淀粉芽胞桿菌化的16SrDNA基因部分核 巧酸序列。
[0021] 序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明分離株解淀粉芽胞桿菌化的gy巧基因的核巧酸序 列。
[0022] 圖1 :是本發(fā)明分離篩選的解淀粉芽胞桿菌化在LB培養(yǎng)基平板上的生長狀態(tài)。
[0023] 圖2:是本發(fā)明分離篩選的解淀粉芽胞桿菌化的革蘭氏染色反應(yīng)鏡檢圖。
[0024]圖3:解淀粉芽胞桿菌化的抗生素敏感性試驗(yàn)圖片。附圖標(biāo)記說明：圖3A為氯霉 素敏感試驗(yàn)圖；圖3B為氨節(jié)西林敏感試驗(yàn)圖；圖3C為巧喃妥因敏感試驗(yàn)圖；圖3D為紅霉 素敏感試驗(yàn)圖；圖3E為四環(huán)素敏感試驗(yàn)圖；圖3F為慶大霉素敏感試驗(yàn)圖；圖3G為諾氣沙 星敏感試驗(yàn)圖；圖3H為環(huán)丙沙星敏感試驗(yàn)圖；圖31為壯觀霉素敏感試驗(yàn)圖；圖3J為萬古 霉素敏感試驗(yàn)圖。 具體實(shí)施方案
[00巧]實(shí)施例1 :芽胞桿菌菌株的分離和鑒定
[0026] -、菌株的分離
[0027] (1)本發(fā)明的生物材料采集湖北武漢某豬場(chǎng)健康豬的直腸內(nèi)容物，將直腸內(nèi)容物 用憐酸鹽緩沖液（PB巧稀釋，用棉簽在（LB)固體培養(yǎng)基（購自美國抓公司）上劃線培養(yǎng)， 置于37°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18~24h。
[0028] (2)挑取平皿上符合芽胞桿菌菌落特征的菌落接種于裝有LB培養(yǎng)基的平皿，置于 培養(yǎng)箱，于37°C靜置培養(yǎng)2地，最后進(jìn)行染色鏡檢。
[0029] 本發(fā)明的分離株（芽胞桿菌）在LB培養(yǎng)基中的生長特性見圖1，其革蘭氏染色特 性見圖2。
[0030] 二、分離株的生理生化鑒定
[0031] 對(duì)篩選出的分離株進(jìn)行生理生化鑒定（鑒定項(xiàng)目見表1)，進(jìn)一步鑒定到種。將鑒 定結(jié)果（見表2)與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中關(guān)于芽胞桿菌屬種間鑒別的描述相對(duì)照。初 步確定分離株是芽胞桿菌。
[0032] 表1分離株（芽抱桿菌）生化鑒定項(xiàng)目

[0035] 表2分離株（芽抱桿菌）生化鑒定結(jié)果

[003引 S、分離株種的確證
[0039] 在上述鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)上述分離株（芽抱桿菌分離株）進(jìn)行16SrRNA基 因序列檢測(cè)和gy巧基因鑒定，對(duì)菌株所屬的種