TT活性對(duì)生色測(cè)定活性的程度為FVIII-BDD活性的約30倍（表4)。
[0165] 轟1
[0167] 通過TGA使用組織因子（TF)作為引發(fā)劑進(jìn)一步評(píng)估Var97在凝固中的效力。TGA 按照制造商推薦的實(shí)施（Diagnostica Stago ;Asni6res sur Seine, France)。簡(jiǎn)言之，將 FVIII(BDD、D519VE665V或變體）添加到具有終濃度IpM TF 4μΜ PL混合物的人血友病 A血漿中，如上文所述。反應(yīng)通過添加凝血酶底物和CaCl2(Flu-Ca)的混合物啟動(dòng)，并監(jiān)測(cè) 60min。本文中報(bào)告的TGA結(jié)果代表一式三份實(shí)驗(yàn)的均值。由于使用低水平的TF，TGA可能 更密切地反映生理凝固。通過TGA，Var97清楚地比FVIII-BDD或D519VE665V-FVIII蛋白 更有效力，相對(duì)于那些親本分子引發(fā)凝血酶生成中的非常快速的增加（圖3)。Var97與其 親本D519VE665V-FVIII之間的凝血酶概況的比較清楚顯示了另外的突變通過增加凝血酶 激活的容易性（更短的延遲）和增強(qiáng)的FXa生成（凝血酶生成的更快的發(fā)生速率和更大范 圍）的貢獻(xiàn)。
[0168] 盡管其對(duì)于引發(fā)凝血酶應(yīng)答的增強(qiáng)的能力，總體Var97凝血酶概況從定性而言非 常類似于FVIII-BDD和D519VE665V-FVIII，其中返回基線凝血酶水平的速率與峰值凝血酶 水平相關(guān)（圖3)。這表明Var97未改變調(diào)節(jié)血漿中凝血酶水平的機(jī)制。這些結(jié)果預(yù)測(cè)Var97 可能不引起高于FVIII-BDD或D519VE665V-FVIII蛋白的額外的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)或系統(tǒng)性凝 血風(fēng)險(xiǎn)。
[0169] 相對(duì)于測(cè)試的其他FVIII分子的Var97效力的定量比較指示促凝血測(cè)定（TGA和 aPTT)結(jié)果之間的一致性。引發(fā)限定量的峰值凝血酶所需的Var97的濃度的比較指示Var97 比其親本D519VE665V-FVIII的效力大~10倍，且比FVIII-BDD的效力大~100倍（圖4)。 通過aPTT的類似評(píng)估指示需要少~10倍的Var97來引發(fā)與D519VE665V-FVIII相同的凝 固時(shí)間（圖5)。
[0170] 使用FXase動(dòng)力學(xué)測(cè)定法檢查Var97變體在其生理學(xué)酶復(fù)合物中的功能。這 些 FXase 動(dòng)力學(xué)測(cè)定法在 IOmM HEPES pH 7. 4, 150mM NaCl, 5mM CaC12, 0· 01 % Tween 20,0·01%BSA和10μMPL(40:40:20，v/v/vPS:PC:PE)中實(shí)施。在這些FXase動(dòng)力學(xué)測(cè) 定法中，通過與20nM凝血酶溫育生成純化的FVIIIa蛋白。將FVIII水平保持固定于IOpM 并與各種濃度的FIXa(O-IOnM)反應(yīng)，或?qū)IXa水平保持固定于（IOOpM)并改變凝血酶激 活的FVIIIa的水平（O-IOnM)。將FX(150nM)添加到任一類型的反應(yīng)，且在Imin后通過添 加 EDTA停止FXase反應(yīng)。使用S-2765生色底物測(cè)量這些反應(yīng)中生成的FXa的量。然后將 FXa生成從標(biāo)準(zhǔn)曲線外推，該標(biāo)準(zhǔn)曲線將FXa水平與生色底物切割的速率關(guān)聯(lián)。將數(shù)據(jù)擬 合于標(biāo)準(zhǔn)Michaelis-Menten等式以推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。繪出該數(shù)據(jù)以顯示FXa活性生成如 何隨FIXa濃度而變化。該分析的結(jié)果顯示于表5和圖6。如表5顯示的，Var97變體相比 于Wt-FVIII或FVIII-BDD多肽具有增強(qiáng)的FX激活速率。另外，圖6例示了 Var97變體顯 示對(duì)FIXa的增加的結(jié)合親和力。實(shí)際上，Var97顯示比FVIII-BDD多肽大至少4倍的對(duì)于 FIXa的結(jié)合親和力。
[0171] 表 5 ：
[0174] 可以分析凝固溶液隨時(shí)間過程的濁度以研究凝固動(dòng)力學(xué)和所得凝塊的結(jié)構(gòu)。之前 已顯示凝固期間的濁度變化相對(duì)于時(shí)間概況可通過降低相比于生理水平的凝固因子的濃 度來誘導(dǎo)，且進(jìn)一步地濁度概況中的這類變化與凝塊的血纖蛋白結(jié)構(gòu)中的變化相關(guān)。參見 例如 Weisel 和 Nagsawami, Biophys. J.，63:111-28 (1992)。如 Weisel 和 Nagsawami 描述的 實(shí)施濁度分析，其使用正常血漿、FVIII缺陷性血漿或含有50mU/mL的多種因子VIII變體的 FVIII缺陷性血漿。如圖7中顯示的，向FVIII缺陷性血漿引入50mU/mL BDD或D519VE665V 產(chǎn)生的濁度概況（吸光度單位[AU]對(duì)時(shí)間[sec])不同于正常血清的；這兩種變體中濁度 的升高遠(yuǎn)不及在正常血清樣品中觀察到的那么快速。除了指示BDD和D519VE665V的凝固動(dòng) 力學(xué)沒有正常血清中那么快以外，這還表明50mU/mL的BDD或D519VE665V變體的存在可能 產(chǎn)生與正常凝固期間產(chǎn)生的不同的凝塊結(jié)構(gòu)和體系。相比之下，引入50mU/mL Var97因子 VIII變體產(chǎn)生的濁度概況與正常血清樣品的相當(dāng)類似，表明與正常凝固的密切類似的凝固 動(dòng)力學(xué)和凝塊結(jié)構(gòu)。
[0175] 作為對(duì)Var97變體的進(jìn)一步表征，實(shí)施研究以比較BDD和Var97在HemA小鼠中保 護(hù)免于血管損傷的死亡的能力。對(duì)HemA小鼠施用不同濃度的多種FVIII且在24小時(shí)后， 如描述的橫切HemA小鼠的尾靜脈（Mei等，Blood(2010) 116:270-279.)。監(jiān)測(cè)HemA小鼠 存活24小時(shí)并將FVIII變體功效評(píng)估為24小時(shí)存活。然后，將施用的多種劑量的存活率 繪圖（以以8/1^和11]/1^兩者）并從圖中確定產(chǎn)生50%存活伍050)需要的800和￥&"7 的劑量（圖8和表6)。如其顯示的，使用Var97在比用BDD低~2-3倍的劑量實(shí)現(xiàn)了 50% 存活率。這與本文中論述的其他測(cè)試的結(jié)果較好地關(guān)聯(lián)，表明Var97的增強(qiáng)的效力和通過 Var97產(chǎn)生的改進(jìn)的凝塊結(jié)構(gòu)。
[0176] 表 6 ：
[0178] 使用變化的FIXa和固定的FVIIIa的動(dòng)力學(xué)FXase結(jié)果（未顯示）表明蛋白水解 可能引起Var97的不同的aPTT對(duì)生色測(cè)定活性。為了研究變體因子VIII多肽的切割，使 在存在過量FIXa的情況下FXase反應(yīng)中的FVIII物理變化可視化。為了檢測(cè)存在于FXase 的通過FIXa的FVIIIa切割，將檢查的因子VIII多肽在標(biāo)準(zhǔn)Xase反應(yīng)緩沖液中調(diào)整為 0. 1 μ g/ml終濃度，其中不存在牛血清清蛋白。將FVIII溶液（25 μ L)添加到5 μ 1的120nM IXa或緩沖液。允許反應(yīng)物在37°C溫育lhr，并添加4X nupage緩沖液以停止反應(yīng)。然后 對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE繼之以考馬斯藍(lán)染色（圖9)。該分析證明相對(duì)于BDD和D519VE665V 變體FVIII之一或兩者，Var97因子VIII變體顯示由FIXa的增強(qiáng)的蛋白水解切割。
[0179] 實(shí)施例 3 :Var97_R336I 的表征
[0180] 在示圖降低Var97的增強(qiáng)的蛋白水解切割的努力中，在Var97肽鏈內(nèi)進(jìn)行一個(gè) 額外的取代R336I(Var97-R336I;SEQ ID N0:55)。這是在對(duì)激活的蛋白C(aPC)的已知 切割位點(diǎn)內(nèi)的取代。如可在圖9的SDS-PAGE凝膠圖像中看到的，在FIXa消化測(cè)定法中， Var97-R336I的蛋白水解切割相比于Var97顯著降低。
[0181] 還通過TGA評(píng)估凝固變體中Var97-R3361變體的效力，其使用組織因子（TF) 作為引發(fā)劑，如上文描述的。通過TGA，Var97-R336I比BDD效力更高，盡管比Var97和 D519VE665V效力稍低（圖10)。另外，總體Var97-R336I凝血酶概況再次定性上非常類似 于BDD，D519VE665V和Var97,其中返回基線凝血酶水平的速率與峰值凝血酶水平關(guān)聯(lián)（圖 10)。引發(fā)限定量的峰值凝血酶所需的BDD, D519VE665V, Var97和Var97-R336I因子VIII 變體的濃度的定量比較表明，Var97-R336I與D519VE665V-FVIII具有類似的效力（圖11)。
[0182] 為了進(jìn)一步表征Var97_R336I變體，將該變體的濁度概況與其他變體，以及正常 血清對(duì)照比較，如上文描述的。如圖7中顯示的，Var97-R336I變體的濁度概況密切類似于 BDD和D519VE665V變體的濁度概況，表明相似的凝固動(dòng)力學(xué)和凝塊結(jié)構(gòu)。
[0183] 本文中描述的變體多肽，包括Var97在內(nèi)，具有針對(duì)多種臨床適應(yīng)證的應(yīng)用。對(duì)于 血友病A，這類具有快速和增強(qiáng)的凝血酶應(yīng)答概況的分子可極性或防護(hù)性使用，通過iv或 sc路徑施用。這些變體還可以用于治療其他出血病癥，不管是來自血小板或凝固缺陷的。在 血小板介導(dǎo)的出血中缺陷的情況中（由于血小板數(shù)目或應(yīng)答不足），這些變體生成凝血酶 的增強(qiáng)的能力可進(jìn)行潛在地彌補(bǔ)，其通過增強(qiáng)血小板活性或通過提供更多的血纖蛋白"膠" 來支持有效出血所需的血小板栓。
[0184] 除了血友病和其他出血病癥外，這些變體引發(fā)這類快速凝血酶應(yīng)答的能力指示了 在更急性情況中的可能效用，如創(chuàng)傷和手術(shù)。在這些背景中，這些變體能支持凝血酶應(yīng)答的 快速性和穩(wěn)健性，對(duì)于調(diào)節(jié)凝血酶水平的機(jī)制的最小影響，可能是優(yōu)勢(shì)所在。在那些背景 中，這些變體可以以多種方式施用，包括iv，SC和局部，以噴霧或浸泡在基質(zhì)中的形式，如 外科海綿或膠原。這些變體可能具有效用的其他適應(yīng)證包括治療出血綜合征，如登革出血 熱，其中大量血管通透性、受損的血小板功能、和增強(qiáng)的血纖蛋白溶解可能導(dǎo)致致命的內(nèi)出 血。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種因子VIII多肽的變體，其中所述因子VIII多肽是包含氨基酸位置370-375處 的凝血酶切割位點(diǎn)和氨基酸位置558-565處的活化環(huán)的功能性因子VIII，其中所述氨基酸 位置編號(hào)依照SEQIDNO: 1中列出的氨基酸序列；且其中所述變體包含在所述凝血酶切割 位點(diǎn)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)殘基處的氨基酸取代和在所述活化環(huán)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)殘基處的氨基酸取 代。2. 權(quán)利要求1的變體，其中所述凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的所述取代不包括在氨基酸位置 372處的取代。3. 權(quán)利要求1或2的變體，其中所述因子VIII多肽還包含包括氨基酸殘基E272和 D519的A1-A2域界面和包括氨基酸殘基E665和E1984的A2-A3域界面，其中所述氨基酸位 置編號(hào)依照SEQIDNO: 1中列出的氨基酸序列；且其中所述變體還包含在所述A1-A2域界 面的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的取代和在所述A2-A3域界面的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處 的取代。4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的變體，其中所述凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的所述取代包含在選自 下組的一個(gè)或多個(gè)位置處的取代：370、371和374。5. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的變體，其中所述凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的所述取代包含在選自 下組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處的取代：370、371和374。6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的變體，其中所述活化環(huán)內(nèi)的所述取代包含在選自下組的一 個(gè)或多個(gè)位置處的取代：559、562和565。7. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的變體，其中所述活化環(huán)內(nèi)的所述取代包含在選自下組的兩 個(gè)或多個(gè)位置處的取代：559、562和565。8. 權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的變體，其中對(duì)所述A1-A2域界面的所述取代包含選自下組 的一個(gè)或多個(gè)取代：E272A、E272V、D519A和D519V。9. 權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的變體，其中對(duì)所述A2-A3域界面的所述取代包含選自下組 的一個(gè)或多個(gè)取代：E665A、E665V、E1984A和E1984V。10. 權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的變體，其中對(duì)所述A1-A2域界面的所述取代包含D519V且 其中對(duì)所述A2-A3域界面的所述取代包含E665V。11. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體包含在選自由370、371和374組成 的組的一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸取代和在選自由559、562和565組成的組的一個(gè)或多個(gè) 位置處的氨基酸取代。12. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體包含在選自由370、371和374組成 的組的兩個(gè)或更多個(gè)位置處的氨基酸取代和在選自由559、562和565組成的組的兩個(gè)或更 多個(gè)位置處的氨基酸取代。13. 權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的變體，其中所述氨基酸取代選自下組：Q370M，I371P， V374F，V559L，R562W，R562F，R562K和Q565E。14. 權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體包含在所述凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的氨 基酸取代，其選自下組： (i)Q370M和I371P，和 (ii)I371P和V374F; 且包含在所述活化環(huán)內(nèi)的氨基酸取代，其選自下組： (i)V559L和R562F， (ii)V559L和R562W， (iii)V559L和Q565E， (iv)V559L，R562W和Q565E，和 (v)V559L，R562F和Q565E。15. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體包含氨基酸取代I371P，V374F， V559L，R562W和Q565E。16. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體包含氨基酸取代I371P，V374F， V559L，R562W，Q565E，D519V和E665V。17. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體還包含在氨基酸位置336處的氨基 酸取代。18. 權(quán)利要求17的變體，其中所述在氨基酸位置336處的氨基酸取代包括R336I取代。19. 權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的變體，其中所述因子VIII多肽包含與SEQIDNO: 1，2， 或3的序列至少90 %相同的氨基酸序列。20. 權(quán)利要求1的變體，其中所述因子VIII多肽包含SEQIDN0:53的氨基酸序列。21. 權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體相比于未經(jīng)修飾的因子VIII多肽具 有增加的比活性。22. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的變體因子VIII多肽和藥學(xué)可接 受的賦形劑。23. -種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的變體因子VIII多肽。24. 包含權(quán)利要求23的核酸序列的載體。25. 權(quán)利要求24的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。26. -種重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求23的分離的核酸或權(quán)利要求24或25的載體。27. -種產(chǎn)生變體因子VIII多肽的方法，所述方法包括（a)在適宜所述變體因子VIII 多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求26的重組宿主細(xì)胞，和（b)分離所述變體。28. -種用于預(yù)防或治療出血病癥的方法，包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求1-21 中任一項(xiàng)的變體因子VIII多肽或權(quán)利要求22的藥物組合物。29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述出血病癥是慢性出血病癥。30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述出血病癥是急性出血事件。
【專利摘要】本公開涉及變體因子VIII多肽，其在凝血酶切割位點(diǎn)和活化環(huán)之一或兩者中的一個(gè)或多個(gè)位置處包含氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，該變體因子VIII多肽包含在凝血酶切割位點(diǎn)和活化環(huán)兩者中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述變體因子VIII多肽還包含在A1-A2域界面和A2-A3域界面內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。本公開還涉及產(chǎn)生和/或使用這類變體因子VIII多肽的方法：編碼該多肽的核酸；含有這類核酸的載體和/或重組細(xì)胞、組織或生物體；和含有這類多肽和/或核酸的試劑盒和藥物組合物。
【IPC分類】A61P7/04, C07K1/00, A61K38/37, C07K14/00, C07K14/755
【公開號(hào)】CN105209488
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480027204
【發(fā)明人】U.格里特贊, P.克雷奇默, L.萊昂格, C.帕特爾
【申請(qǐng)人】拜耳醫(yī)藥保健有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月14日
【公告號(hào)】CA2906602A1, EP2988758A1, EP2988758A4, US20160031968, WO2014152530A1