變體因子viii多肽及其產(chǎn)生和使用方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】變體因子Vl I I多肽及其產(chǎn)生和使用方法
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月15號(hào)提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/789, 112的權(quán)益，其通 過(guò)提述完整并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本文中提供了人凝固因子VIII變體和編碼這類(lèi)變體的多核苷酸，包含和表達(dá)這 類(lèi)變體的載體和宿主細(xì)胞，獲得這類(lèi)變體的方法，使用這類(lèi)變體的方法，變體的組合物，和 與其相關(guān)的另外的發(fā)明特征。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 血液凝固是由多種血液組分（或因子）之間復(fù)雜的相互作用組成的逐漸導(dǎo)致纖 維蛋白凝塊形成的過(guò)程。通常參與被常稱(chēng)為凝固"級(jí)聯(lián)反應(yīng)"的血液組分是不具有酶活性 的蛋白（原酶或酶原），通過(guò)激活劑的作用使其轉(zhuǎn)化為蛋白水解酶，所述激活劑本身常常是 激活的凝固因子。對(duì)凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵性的一種肽是因子VIII或FVIII。事實(shí)上，最常見(jiàn) 的遺傳性凝血病癥血友病A是由因子VIII中的缺陷或結(jié)構(gòu)性缺陷導(dǎo)致的。因子VIII的 生物化學(xué)允許針對(duì)凝固的快速打開(kāi)/關(guān)閉轉(zhuǎn)換。它作為無(wú)活性的輔因子循環(huán)，通過(guò)凝血酶 (凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)的倒數(shù)第二個(gè)酶）被活化為FVIIIa。FVIIIa與FIXa、膜或磷脂（PL)表面 和Ca+2-起參與一種短壽命的酶復(fù)合物（FXase)以將FX轉(zhuǎn)化成FXa。FVIIIa作為FXase 復(fù)合物中的參與者的主要功能是突出地增多FXa，由此允許凝血酶生成。因子VIII由~ 186kb基因編碼，該基因由26個(gè)外顯子組成（Thompson, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 29:11-22 (2003)(參考文獻(xiàn)11和16-18))。該基因的mRNA的翻譯繼之以19個(gè) 氨基酸的信號(hào)序列的除去，產(chǎn)生2332個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。該蛋白由6個(gè)主要域組成， 其從氨基末端為：AU A2、B、A3、Cl和C2。涉及活化的另外的短酸性區(qū)域al、a2和a3分別 散布在Al和A2、A2和B、和B和A3域之間。這一 2332個(gè)氨基酸的主要翻譯產(chǎn)物被加工成 異二聚體，其由異質(zhì)性重鏈（含有完整的Al，alA2，a2域和多種長(zhǎng)度的B域）和同質(zhì)性80kD 輕鏈（含有a3、A3、Cl和C2域）組成。B域的異質(zhì)性來(lái)自分泌期間的蛋白水解。
[0006] 因子VIII到因子VIIIa的活化一般經(jīng)由通過(guò)凝血酶對(duì)原輔因子（procofactor) 的蛋白水解而發(fā)生。凝血酶識(shí)別限定沿因子VIII肽鏈的凝血酶切割位點(diǎn)的特定氨基酸區(qū) 域。因子VIII具有3個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)。對(duì)其他凝血酶底物的檢查揭示了可被凝血酶容納 的多個(gè)殘基。盡管在這些凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸可在一定程度上變化，但某些氨基酸 比之其他氨基酸在這些切割位點(diǎn)內(nèi)要更常見(jiàn)得多，且某些氨基酸殘基引起凝血酶對(duì)該肽的 更有效的切割。（參見(jiàn)例如Newell-Caito 等，"P3_P3'Residues flanking Scissile Bonds in Factor VIII Modulate Rates of Substrate Cleavage and Profactor Activation by Thrombin1Tiochemistry 51:3451-59(2012) ;Gallwitz 等，"The Extended Cleavage Specificity of Human Thrombin,'TLoS ONE 7:e31756(2012))。因子 VIII 中的 3 個(gè)凝血 酶切割位點(diǎn)之一位于或接近al-A2接合處，其位于或接近成熟野生型人因子VIII肽的氨基 酸位置370-375處。
[0007] 在切割后，活性因子Villa是包含Al亞基、A2亞基和A3C1C2亞基的異三聚體。該 異三聚體由在亞基彼此相互作用所在區(qū)域處的亞基之間的靜電和疏水性相互作用兩者支 持，所述區(qū)域稱(chēng)為"域界面"。已知該異三聚體包含至少A1-A2和A2-A3域界面。（參見(jiàn)例 如美國(guó)專(zhuān)利吣.8,338,571(2008年7月25日提交）（2012年12月25日授權(quán)））。
[0008] 人因子VIII被重組生產(chǎn)為約300kD的單鏈分子。該前體產(chǎn)物在高爾基體（Golgi Apparatus)中被加工成200kD(重鏈）和80kD(輕鏈）的兩條多肽鏈，這兩條鏈通過(guò)金 屬離子被保持在一起（Kaufman 等，J. Biol. Chem. 263:6352 (1988) ;Andersson 等，Proc. Natl.Acad. Sci.83:2979(1986))。FVIII的B域似乎是可有可無(wú)的，因?yàn)锽域缺失的 FVIII (FVIII-BDD ;90kD A1-A2重鏈加80kD輕鏈）已顯示為是血友病A的有效替換療法。 稱(chēng)為"BDD-SQ"或簡(jiǎn)稱(chēng)為"BDD"的一種公知的B域缺失的因子VIII序列含有除14個(gè)氨基 酸以外的B域全部缺失。
[0009] 對(duì)血友病A的治療目前涉及按需要或作為防護(hù)療法靜脈內(nèi)（iv)施用因子VIII。盡 管對(duì)于全長(zhǎng)蛋白其有超過(guò)300kD的較大大小，但因子VIII在人中的半衰期僅為約11小時(shí)。 (Ewenstein等，Semin. Hematol. 41:1-16(2004))。因此，必須相對(duì)頻繁地施用因子VIII以 用于對(duì)凝血病癥的防護(hù)性治療。因子VIII通常每周施用兩至三次，給藥基于因子VIII活 性。這種對(duì)頻繁iv注射的需要給患者依從性創(chuàng)造了巨大的障礙。如果能開(kāi)發(fā)出不需要那 么頻繁施用的因子VIII產(chǎn)品，對(duì)于患者將是更方便的。此外，降低需要的劑量數(shù)目也會(huì)降 低治療的成本。另外，即使使用這些頻繁施用，由于其短半衰期，進(jìn)行因子VIII替換療法的 患者也經(jīng)常在血漿因子VIII活性水平中產(chǎn)生較大的擺動(dòng)，從而給其帶來(lái)潛在的血栓癥（在 峰值水平）和出血（在低谷水平）的風(fēng)險(xiǎn)。
[0010] 另外，備選的非iv施用路徑如皮下（SC)施用可以通過(guò)將血漿因子VIII水平維持 在更恒定的水平既增加治療的容易性又降低血栓癥和出血的潛在風(fēng)險(xiǎn)。Sc投遞的一項(xiàng)挑 戰(zhàn)是增加施用的因子VIII的生物利用度。具有增強(qiáng)的活性的因子VIII肽可能對(duì)于增強(qiáng) 生物利用度有用，因此可能可用于因子VIII的SC投遞。由于其較高的比活性（specific activity)，這類(lèi)因子VIII肽可能允許施用所需體積的減少，因?yàn)樗幬锏幕钚詽舛雀?。?低的注射體積能減少患者不適。此外，體積降低還將轉(zhuǎn)化成貨品成本的降低。最后，增強(qiáng)的 活性因子VIII分子還能賦予在野生型因子VIII之上的額外保護(hù)，其通過(guò)延長(zhǎng)輔因子活性 的持續(xù)時(shí)間（如果給藥是通過(guò)質(zhì)量（mass)而非通過(guò)活性的話）。例如，在等質(zhì)量給藥時(shí)，具 有2倍比活性增強(qiáng)的增強(qiáng)活性的FVIII變體在0. 5%水平將提供與野生型FVIII在1 %水 平所提供的相同的保護(hù)，由此延長(zhǎng)因子VIII劑量之間的時(shí)間間期。
[0011] 已生成大量因子VIII變體以試圖解決當(dāng)前醫(yī)學(xué)療法的一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)。例 如，美國(guó)專(zhuān)利No. 8,338,571 (2008年7月25日提交；2012年12月25日授權(quán)）描述了一 種重組因子VIII，其包含一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致因子VIII和因子VIIIa兩者的增強(qiáng)的穩(wěn)定性 的突變。類(lèi)似地，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No. 2012/0190623(2011年1月27日提交）描述了對(duì)失 活抗性的因子VIII突變體，包括"其中APC切割位點(diǎn)Arg336和Ile562被突變"的突變 體。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No. 2011/0124565(2006年4月10日）涉及經(jīng)修飾的核酸序列，其編 碼具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的凝固因子特別是人因子VIII及其衍生物，包括具有以下修飾的因 子VIII肽，該修飾據(jù)報(bào)道阻止FVIII的Al和A2域之間的凝血酶切割。其他努力產(chǎn)生了 例如由于引入了允許肽PEG化的突變而報(bào)告具有增加的循環(huán)半衰期的經(jīng)修飾的因子VIII 多肽（Mei等，Blood 116:270-279(2010))和由于對(duì)構(gòu)成活性FVIIIa異三聚體的域界面 的突變而報(bào)告具有增加的穩(wěn)定性的經(jīng)修飾的因子VIII多肽（Wakabayashi等，J. Thromb. Haemost. 7:438-444(2009))。
[0012] 出于如上文所述的原因，存在對(duì)改進(jìn)的因子VIII變體，例如具有增加活性的變體 和/或不需要那么頻繁和/或高劑量施用的變體的需要。此外，期望這類(lèi)蛋白質(zhì)作為同質(zhì) 性產(chǎn)物以一致性方式生產(chǎn)。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及作為功能性因子VIII的因子VIII多肽變體，該因 子Vin多肽包含氨基酸位置370-375處的凝血酶切割位點(diǎn)和氨基酸位置558-565處的活 化環(huán)，其中所述這些酸位置編號(hào)依照SEQ ID N0:1中列出的氨基酸序列；且其中所述變體包 含在所述凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)殘基處的氨基酸取代和在活化環(huán)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)殘 基處的氨基酸取代。
[0015] 在某些例子中，變體因子VIII多肽的凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的所述取代不包括在氨 基酸位置372處的取代。在其他例子中，凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的取代包含在位置370、371和 374的一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，而在其他例子中，凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的取代包含在位置 370、371和374的兩個(gè)或更多個(gè)位置處的取代。
[0016] 在別的例子中，活化環(huán)內(nèi)的所述取代包含在位置559、562和565的一個(gè)或多個(gè)位 置處的取代，而在其他例子中，活化環(huán)內(nèi)的所述取代包含在位置559、562和565的兩個(gè)或更 多個(gè)位置處的取代取代。
[0017] 在其他例子中，變體因子VIII多肽還包含包括氨基酸殘基E272和D519的A1-A2 域界面和包括氨基酸殘基E665和E1984的A2-A3域界面，其中所述這些氨基酸位置編號(hào)依 照SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列；且其中所述變體還包含在所述A1-A2域界面的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基處的取代和在所述A2-A3域界面的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的取代。在 另外的例子中，A1-A2域界面的所述取代包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)取代：E272A、E272V、 D519A和D519V。在其他例子中，A2-A3域界面的所述取代包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)取 代：E665A，E665V，E1984A和E1984V。在仍進(jìn)一步的例子中，A1-A2域界面的所述取代包含 D519V且A2-A3域界面的所述取代包含E665V。
[0018] 在具體的例子中，變體因子VIII多肽包含在位置370、371和374的一個(gè)或多個(gè)位 置處的氨基酸取代，和在位置559、562和565的一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸取代。在其他 例子中，該變體包含在位置370、371和374的兩個(gè)或更多個(gè)位置處的氨基酸取代，和在位 置559、562和565的兩個(gè)或更多個(gè)位置處的氨基酸取代。在仍進(jìn)一步的例子中，該變體包 含選自下組的氨基酸取代：Q370M，I371P，V374F，V559L，R562W，R562F，R562K和Q565E。在 另外的例子中，該變體包含在所述凝血酶切割位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸取代，其選自下組：（i) Q370M 和I371P，和（ii)I371P和V374F。在仍進(jìn)一步的例子中，該變體包含在所述活化環(huán)內(nèi)的氨 基酸取代，其選自下組：（i)V559L和 R562F, (ii)V559L 和 R562W, (iii)V559L和 Q565E, (iv) V559L, R562W 和 Q565E，以及（V) V559L, R562F 和 Q565E。
[0019] 在某些具體的例子中，該變體包含氨基酸取代I371P，V374F，V559L，R562W和 Q565E。在其他具體的例子中，該變體包含氨基酸取代I371P，V374F，V559L，R562W，Q565E，D 519V和E665V。在仍進(jìn)一步的例子中，該變體還在氨基酸位置336處包含氨基酸取代。在 某些例子中，在氨基酸位置336處的氨基酸取代包括R3361取代。
[0020] 在某些例子中，所述變體因子VIII多肽包含與SEQ ID NO: 1，2或3的序列至少 90%相同的氨基酸序列。在其他例子中，所述變體因子VIII多肽包含SEQ ID N0:53的氨 基酸序列。
[0021] 在某些例子中，所述變體因子VIII多肽相比于未經(jīng)修飾的因子VIII多肽具有增 加的比活性。
[0022] 在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及一種藥物組合物，其包含如本文中描述的 變體因子VIII多肽和藥學(xué)可接受的賦形劑。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及分離的核酸，其編碼如本文中描述的變體因子 VIII多肽。
[0024] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包含編碼如本文中描述的變體因子VIII多肽 的核酸序列的載體。在某些例子中，所述載體是表達(dá)載體。
[0025] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包含本文中描述的分離的核酸或載體的重組宿 主細(xì)胞。
[0026] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及產(chǎn)生變體因子VIII多肽的方法，所述方法包括 在適宜所述變體因子VIII多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)如本文中描述的重組宿主細(xì)胞，和分離 所述變體。
[0027] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及用于預(yù)防或治療出血病癥的方法，包括對(duì)受試 者施用有效量的如本文中描述的變體因子VIII多肽或藥物組合物。在某些例子中，所述出 血病癥是慢性出血病癥。在其他例子中，所述出血病癥是急性出血事件（印isode)。
[0028] 附圖簡(jiǎn)述
[0029] 圖1顯示多種因子VIII多肽和變體的aPTT比活性，呈現(xiàn)為相對(duì)于野生型因子 VIII的倍數(shù)活性。命名具有以下含義："A"指示多肽在凝血酶切割位點(diǎn)中擁有I371P和 V374F氨基酸取代；"B"指示多肽在活化位點(diǎn)中擁有V559L，R562W和Q565E氨基酸取代；而 "C"指示多肽擁有D519V和E665V氨基酸取代。所有氨基酸位置命名均給予Wt-FVIII (SEQ ID NO: 1)中的位置編號(hào)。
[0030] 圖2顯示多種因子VIII多肽和變體的比活性，呈現(xiàn)為相對(duì)于野生型因子VIII的 倍數(shù)活性，如通過(guò)生色測(cè)定法測(cè)定的。命名具有與圖1相同的含義。
[0031] 圖3顯示FVIII-BDD(SEQIDN0:3)，D519VE665V-FVIII(SEQIDN0:5)和Var97的 凝血酶生成概況（profile)，Var97是D519VE665V-FVIII的變體，其具有以下氨基酸取代： I371P，V374F，V559L，R562W 和 Q565E(SEQ ID N0:53)。
[0032] 圖4呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示引發(fā)限定量的峰值凝血酶所需的多種因子VIII多肽和變體 的濃度。研究的因子 VIII 多肽是 FVIII-BDD(SEQ ID N0:3)，D519VE665V-FVIII(SEQ ID N0:5)，具有D519V和E665V氨基酸取代的經(jīng)修飾的FVIII-BDD，和D519VE665V-FVIII的變 體Var97，其具有以下氨基酸取代：I371P，V374F，V559L，R562W和Q565E(SEQIDN0:53)。
[0033] 圖5顯示FVIII-BDD(SEQIDN0:3)，D519VE665V-FVIII(SEQIDN0:5)和Var97 的凝塊形成速率的動(dòng)力學(xué)概況，Var97是D519VE665V-FVIII的變體，其具有以下另外的 氨基酸取代：I371P，V374F，V559L，R562W 和 Q565E(SEQ ID N0:53)。Var97 相對(duì)于 BDD 和 D519VE665V的約高10倍的活性從實(shí)現(xiàn)凝塊形成的最大速率所需的時(shí)間是明顯的。
[0034] 圖6顯示FVIII-BDD(SEQIDN0:3)，D519VE665V-FVIII(SEQIDN0:5)和Var97 的結(jié)合親和力結(jié)果，Var97是D519VE665V-FVIII的變體，其具