施方案中，凝血酶切割位點可以是同源因子VIII多肽如 等位變體或經(jīng)修飾多肽中的同源位點。
[0106] 如本文中使用的，"活化環(huán)"指因子VIII肽鏈的A2亞基的一部分，其能夠與因子 IXa界面連接。在某些實施方案中，所述活化環(huán)位于成熟野生型人因子VIII肽（SEQ ID NO: 1)的氨基酸殘基558-565處。在進一步的實施方案中，所述活化環(huán)可以是同源因子VIII 多肽如等位變體或經(jīng)修飾多肽中的同源位點。
[0107] 如本文中使用的，"域界面"指因子VIIIa異三聚體的相應(yīng)亞基上的區(qū)域或殘基， 其與該異三聚體的其他亞基相互作用。如此，"A1-A2域界面"指Al和A2亞基各自上的區(qū) 域或殘基，其與其他亞基上的相應(yīng)區(qū)域或殘基相互作用。類似地，"A2-A3域界面"指A2和 A3亞基各自上的區(qū)域或殘基，其與其他亞基上的相應(yīng)區(qū)域或殘基相互作用。在某些例子中， A1-A2域界面包含殘基E272和D519(基于SEQ ID N0:1的野生型因子VIII序列）。在其 他例子中，A2-A3域界面包含殘基E665和E1984(基于SEQ ID N0:1的野生型因子VIII序 列）。
[0108] 如本文中使用的，"因子IX"或"FIX"意指凝固因子IX，其也稱為人凝固因子IX或 血漿促凝血酶原激酶成分。
[0109] 如本文中使用的，"因子X"或"FX"意指凝固因子X，其也稱為人凝固因子X和名 為 Stuart-Prower 因子。
[0110] "藥動學(xué)"或"PK"用于本文指藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和消除的特性。藥物 的藥動學(xué)的改進意指使得藥物在體內(nèi)作為治療劑更有效的那些特征中的改進，尤其是它在 體內(nèi)的有用持續(xù)時間。
[0111] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中一般可交換使用且其指單體為氨基酸通 過酰胺鍵連接在一起的聚合物。另外，非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸、和高精 氨酸也包括在內(nèi)。非基因編碼的氨基酸也可以用于本文中描述的技術(shù)。此外，經(jīng)過修飾以 包括反應(yīng)基團、糖基化位點、聚合物、治療模塊、生物分子等的氨基酸也可以使用。本文中使 用的所有氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體。一般優(yōu)選L-異構(gòu)體。如本文中使用的，"多肽"、 "肽"和"蛋白質(zhì)"指糖基化和非糖基化形式兩者。
[0112] 術(shù)語"氨基酸"指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬 物，其以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮功能。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼子編 碼的那些，以及后來修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、γ -羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨 酸。"氨基酸類似物"指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)即結(jié)合氫的Ct碳、羧 基基團、氨基基團和R基團的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲 基锍（sulfonium)。這類類似物具有經(jīng)修飾的R基團（例如正亮氨酸）或經(jīng)修飾的肽主鏈， 但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有不同于氨基酸的一 般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，但以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮功能的化學(xué)化合物。
[0113] "變體"和"突變體"在本文中可交換使用且它們各自指經(jīng)遺傳工程化的多肽或 編碼多肽的核苷酸序列，其產(chǎn)生是對核苷酸或多肽序列進行實驗室誘導(dǎo)的改變的結(jié)果。在 描述氨基酸時，本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)一字母或三字母氨基酸編碼可代填氨基酸的完整名稱使 用。另外，一字母氨基酸編碼繼之以數(shù)字可用于指示開始序列中在具體位置處的具體氨基 酸。例如"V374"將指示在Wt-FVIII序列（SEQ ID NO: 1)的氨基酸位置374處的纈氨酸。 進一步地，在位置編號后可以納入取代氨基酸的一字母編碼以指示進行的具體氨基酸取 代。例如，"V374F"將指示在位置374處取代纈氨酸的苯丙氨酸殘基。"取代"如用于本文 指將一種氨基酸用另一種氨基酸替換且不包括缺失或添加，除非另外明確說明。
[0114] 應(yīng)注意的是，除非具體的例子的語言另外具體地指示，本文中公開的氨基酸位置 均基于成熟野生型因子VIII肽的氨基酸序列中的相應(yīng)位置，如SEQID NO: 1中提供的，如本 領(lǐng)域中常規(guī)所做的。
[0115] 本公開的變體多肽包含在凝血酶切割位點和活化環(huán)之一或兩者中的一個或多個 氨基酸取代。在某些例子中，變體多肽包含在以下之一或兩者中的一個或多個氨基酸取代： 1)凝血酶切割位點，由SEQ ID NO: 1的氨基酸位置370-375代表，和2)活化環(huán)，由SEQ ID NO: 1的氨基酸位置558-565代表。對于殘基370-375處的凝血酶切割位點，切割通常在 R372殘基之后立即發(fā)生，使得該殘基對于在該位點處的適宜切割是重要的。如此，在某些 實施方案中，變體多肽將包含由SEQ ID NO: 1的氨基酸位置370-375代表的凝血酶切割位 點內(nèi)的一個或多個氨基酸取代，其中所述取代不在位置372處。在某些實施方案中，氨基 酸取代可以是在起始序列中下列一個或多個位置處的取代（位置編號基于SEQ ID N0:1的 Wt-FVIII 序列）：Q370, 1371，S373, V374, A375, S558, V559, D560, Q561，R562, G563, N564 和 Q565。在某些其他實施方案中，在那些位置的2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12或13個處可能 有取代。在另外的實施方案中，變體可以在凝血酶切割位點（370-375)和活化環(huán)（558-565) 各自中包含至少一個取代。在某些例子中，變體可以包含Q370, I371，S373，V374和A375的 至少一個的取代，和S558, V559, D560, Q561, R562, G563, N564和Q565的至少一個的取代。 在進一步的實施方案中，變體可以在凝血酶切割位點（370-375)或活化環(huán)（558-565)的任 一中包含超過一個取代，例如2, 3, 4, 5, 6, 7或8個取代。在具體的例子中，變體包含在凝血 酶切割位點（370-375)內(nèi)的兩個取代和在活化環(huán)（558-565)內(nèi)的兩個取代。在其他例子 中，變體包含在凝血酶切割位點（370-375)內(nèi)的兩個取代和在活化環(huán)（558-565)內(nèi)的三個 取代。在具體的例子中，凝血酶切割位點內(nèi)的取代是Q370M，I371P，V374F，Q370M/I371P或 I371P/V374F。在其他例子中，活化環(huán)內(nèi)的取代是 V559L, R562W, R562F, R562K, Q565E, V559L/ R562F, V559L/R562W, V559L/Q565E, V559L/R562W/Q565E 或 V559L/R562F/Q565E。
[0116] 在別的例子中，變體因子VIII多肽還包含對A1-A2和A2-A3域界面的每個內(nèi)的 氨基酸殘基的一個或多個取代。在具體的例子中，A1-A2域界面內(nèi)的取代包含對殘基E272 和D519之一或兩者的取代（基于SEQ ID NO: 1的野生型因子VIII序列）。在某些實施方 案中，這些取代將在E272和D519處的帶電荷的天冬氨酸（D)或谷氨酸（E)殘基之一或兩 者用疏水性殘基，特別是疏水性殘基如丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸替換。在某些例子中，A1-A2域界面內(nèi)的一個或多個取代選自 下組：E272A、E272V、D519A和D519V。在另外的例子中，A2-A3域界面內(nèi)的取代包含對殘基 E665和E1984之一或兩者的取代（基于SEQ ID NO: 1的野生型因子VIII序列）。在某些 實施方案中，這些取代將在E665和E1984處的帶電荷的谷氨酸（E)殘基之一或兩者用疏 水性殘基，特別是疏水性殘基如丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨 酸、苯丙氨酸或色氨酸替換。在進一步的例子中，A2-A3域界面內(nèi)的一個或多個取代選自下 組：E665A，E665V，E1984A和E1984V。在某些例子中，所述變體因子VIII多肽包含D519A/ E665A 取代、D519A/E665V 取代、D519V/E665A 取代或 D519V/E665V 取代。
[0117] 在某些例子中，變體因子VIII多肽的制備牽涉對編碼因子VIII多肽的核酸 序列的定點誘變。核苷酸序列的這類定點突變可通過本領(lǐng)域已知的任意方法進行且本 領(lǐng)域技術(shù)人員將能容易地確定用于手頭上具體應(yīng)用的適宜的誘變技術(shù)。在某些例子 中，使用商品化的定點誘變試劑盒如Stratagene QuickChange? II定點誘變試劑盒、 Clontech Transformer 定點誘變試劑盒no. K1600_l、Invitrogen GenTaylor 定點誘變系統(tǒng) no. 12397014、Promega Altered Sites II體外誘變系統(tǒng)試劑盒no. Q6210、或Takara Mirus Bio LA PCR誘變試劑盒no. TAK RR016完成誘變。
[0118] 在某些實施方案中，當(dāng)與起始因子VIII多肽相比時，變體因子VIII多肽將在至 少一種活性測定中具有增加的活性。任何適用于測試因子VIII活性的測定法可用于本公 開的變體多肽，且這類測定法是本領(lǐng)域中公知的。這類活性測定法包括但不限于：aPTT ; 用于FVIII的生色或生熒光（fluorogenic)底物測定法，從FXase復(fù)合物的個體組分組 裝或作為試劑盒；凝血酶生成測定法或測試（TGA或TGT)或校準(zhǔn)的自動化凝血酶成像術(shù) (thrombography) (CAT);和旋轉(zhuǎn)性凝血酶彈性測定法（thromboelastometry) (ROTEM)或旋 轉(zhuǎn)型凝血酶彈性成像術(shù)（thromboelastography) (ROTEG)。
[0119] aPTT可以指一階段或不太常見的兩階段測定，其中凝固檢測為實現(xiàn)預(yù)限定的樣品 濁度或粘度所需要的時間（凝固時間或CT)。由于aPTT是基于血漿的測定法，其用于評估 血漿中的潛在因子VIII活性和功能。在典型的一階段aPTT中，將含有FVIII的血漿樣品 與帶負電荷的表面或顆粒和Ca+2溫育以啟動凝血。在一階段測定中，F(xiàn)XIa、FVIIIa、FXa、凝 血酶和血纖蛋白生成在一個反應(yīng)中發(fā)生。在兩階段測定中，F(xiàn)XIa、FVIIIa和FXa生成在第 一階段發(fā)生而凝血酶和血纖蛋白生成在第二階段中發(fā)生?？梢詫σ浑A段和兩階段aPTT修 改以使得測定法特異于FVIII定量，如在FVIII特異性因子測定法中的。
[0120] 生色底物測定法（色測定）是設(shè)計為評估FXase復(fù)合物（FIXa，PL，Ca+2和FX)背 景中的FVIII功能的兩階段測定法。在該測定法中，F(xiàn)VIIIa被完全激活，且FIXa和PL過 量，這是生理上不通常遇到的情況。在該測定法中，在第一階段將FVIIIa與FXase復(fù)合物 的純化的或相對純化的組分組合以生成FXa。在第二階段中，生成的FXa的水平通過在由 FXa切割時產(chǎn)生顏色的底物來定量。生色測定法的變型包括將生色底物用生熒光底物替換， 并檢測熒光發(fā)射（生熒光測定法）。
[0121] TGA，F(xiàn)VIII促凝血功能的另一種測定法，通過用生理引發(fā)劑（initiator)如組織 因子（TF)或FXIa在存在磷脂（PL) (40:40:20, v/v/v磷酯酰絲氨酸：磷脂酰膽堿：磷脂酰 乙醇胺）的情況下激活含有FVIII的血漿以刺激激活的血小板的膜表面來實施。凝血酶生 成（和凝固）起始于對樣品添加 Ca+2和凝血酶的生熒光底物。在CAT中，焚光隨時間的變 化隨后與凝血酶濃度相關(guān)，其通過監(jiān)測含有限定水平的凝血酶的并行樣品中熒光變化的速 率。描述凝血酶生成概況中的動力學(xué)變化的參數(shù)可包括應(yīng)答開始前的時間（延遲（lag)) 和實現(xiàn)的峰值凝血酶（峰值）。
[0122] R0TEM/R0TEG類似于TGA，只不過監(jiān)測隨凝固的粘度的進展而不是凝血酶生成。同 樣，凝固在含有FVIII的血漿中通過Ca+2或TF-PL混合物啟動。描述粘度中的動力學(xué)變化 的參數(shù)可包括凝固啟動時間（CT)和粘度變化速率（α角）。
[0123] 在某些例子中，變體因子VIII多肽的活性將通過一種或多種測定法測試。注意由 于這些FVIII變體的作用機制中的變化和測定法檢測FVIII功能的特定方面的能力，僅某 些測定法將檢測因子VIII活性中的顯著增強。因此，在某些例子中，變體因子VIII多肽在 一個測定法中可能具有與Wt-FVIII可比的活性而在另一測定法中擁有增加的活性。例如， 變體在生色測定法中可能具有與Wt-FVIII可比的活性而當(dāng)使用aPTT測定法或凝血酶生成 測定法測試時擁有增加的活性。這可以發(fā)生在例如變體具有增強的催化活性但也更易感于 蛋白水解性降解時發(fā)生。對于一些變體，對增強的活性最敏感的測定法可能是一階段aPTT 和TGA，而非生色測定法。凝固蛋白的測定表現(xiàn)中的這類差異并非不常見的，特別是當(dāng)突 變處于影響特定功能而非其他的域中時（Leong等，Biochemistry 31:2567(1992) ;Stone 等，Biochemistry 30:6392(1991) ;Henriksen 和 Mann, Biochemistry 28:2078(1989))。 這些結(jié)果可能表明這些變體可能具有更易于被激活的優(yōu)勢，即加速從FVIII至FVIIIa的轉(zhuǎn) 化，其然后能轉(zhuǎn)換成增強的凝血酶生成。
[0124] 在某些例子中，變體因子VIII多肽將擁有大于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、 FVIII-BDD或D519VE665E-FVIII的活性。這些活性將使用在可比條件下產(chǎn)生的多肽測 量，所述條件如變體和起始多肽在同一類型的細胞系中在可比條件下的重組表達。在某 些實施方案中，在至少一種測定法中相對于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、FVIII-BDD、或 D519VE665E-FVIII活性將增加至少I. 1倍。在其他實施方案中，在至少一種測定法中相對 于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、FVIII-BDD、或D519VE665E-FVIII活性將增加至少約1. 2 倍、1. 3 倍、1. 4 倍、1. 5 倍、1. 6 倍、1. 7 倍、1. 8 倍、1. 9 倍、2. 0 倍、2. 5 倍、3. 0 倍、3. 5 倍、4. 0 倍、4. 5 倍、5. 0 倍、5. 5 倍、6. 0 倍、6. 5 倍、7. 0 倍、7. 5 倍、8. 0 倍、8. 5 倍、9. 0 倍、9. 5 倍、10 倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24 倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38 倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、55倍、60 倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、100 倍、110 倍、120 倍、130 倍、140 倍、150 倍、160 倍、170 倍、180 倍、190 倍、200 倍、210 倍、220 倍、230 倍、240 倍、250 倍、260 倍、270 倍、280 倍、290 倍、300 倍、310 倍、320 倍、330 倍、340 倍、350 倍、360 倍、370 倍、380 倍、390 倍、400 倍、450倍、500倍，或更高。
[0125] 仍在別的實施方案，在至少一種測定法中相對于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、 FVIII-BDD、或 D519VE665E-FVIII 活性將增加約 L 2 至 10 倍、L 2 至 12 倍、L 2 至 14 倍、L 2 至16倍、1. 2至18倍、1. 2至20倍、1. 2至30倍、1. 2至40倍、1. 2至50倍、1. 2至60倍、 1. 2 至 70 倍、1. 2 至 80 倍、1. 2 至 90 倍、1. 2 至 100 倍、1. 3 至 10 倍、1. 3 至