MSP)
[01化]1.ASS1基因甲基化及非甲基化引物設(shè)計與合成陽106] MSP引物： 陽107] 甲基化檢測引物：
[0108]上游引物：GTTTTGACGTTTTTAAGTAGTACGA(SEQ ID NO.6);
[0109]下游引物：AAAAAAAATAACCTCGCGTC(SEQ ID NO.7);
[0110] 擴增長度16化p; 陽111] 非甲基化檢測引物：
[0112]上游引物：TTTTGATGTTTTTAAGTAGTATGA(SEQ ID NO.8);
[0113]下游引物：AAAAAAAATAACCTCACATC(SEQ ID NO.9);
[0114] 擴增長度為164bp。
[0115]引物設(shè)計后送公司合成。
[0116] 2. MSP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 陽117] MSP反應(yīng)體系：2X服PCR Mix 12. 5yl ;M/U上游引物（lOyM)和M/U下游引物 (10 y M)個1 y 1 ;模板1 y 1 ;加滅菌水補平至25 y 1 ;
[0118] 反應(yīng)條件：預(yù)反應(yīng)：94°C5min;反應(yīng)35個循環(huán)（94°C30秒，60°C30秒，72°C30 秒）；延伸 72°C5min。
[0119] 反應(yīng)結(jié)束后取出進行瓊脂糖凝膠電泳分析。 陽120] 3.實驗結(jié)果 陽121] 非甲基化特異性引物的擴增產(chǎn)物存在，甲基化特異性引物的擴增產(chǎn)物不存在即為 非甲基化；非甲基化特異性引物的擴增產(chǎn)物不存在，甲基化特異性引物的擴增產(chǎn)物存在即 為甲基化。電泳結(jié)果顯示：37例骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中，甲基化陽性的有28例，基因 甲基化率為75. 68%，9例對照滑膜組織中甲基化陽性的僅有2例，基因甲基化率為22. 22% (見表1，圖1)。
[0122] 表1骨性關(guān)節(jié)炎組和對照組ASS1基因甲基化情況 陽123]
[0124]實施例6 WB方法檢測骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中ASS1的表達 [01巧]一、蛋白質(zhì)樣品制備及定量 陽126] 1. RIPA裂解液度eyotime)進行蛋白質(zhì)樣品制備，操作步驟如下：
[0127] 將滑膜組織自冰箱取出，用濾紙擦拭組織上的PBS溶液，稱取重量，并將滑膜組織 置于機械組織勻漿器中，1:10組織比裂解液的重量體積比例加入相應(yīng)體積的裂解液進行勻 漿，10000-14000g離屯、3-5分鐘，取上清液，按1:1加入樣品緩沖液強力混勻后置于100度 的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，lOOOOg離屯、10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中。
[0128] 2.利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行總蛋白定量
[0129] 采用康為世紀微量BCA蛋白定量試劑盒（貨號：CW2011)，具體步驟見其說明書。
[0130] 二、SDS-聚丙締獻胺凝膠電泳（SDS-PAGE) 陽131] 1.蛋白質(zhì)樣品變性： 陽13引a)根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果，每個凝膠加樣孔中加入相同質(zhì)量的總蛋白提取 物。按照每1微升蛋白樣品加入0. 25微升蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上 樣緩沖液巧X)。 陽133]b) 100°C或沸水浴加熱3-5分鐘，W充分變性蛋白。 陽134] C)冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 陽135] 2.膠板制備：
[0136] 采用Bio-Rad公司的微型垂直板電泳裝置制備0. 75mm厚的凝膠，照說明書安裝好 玻璃板后，先在小燒杯中配制5ml 10%的分離膠，配方如下：
[0137]分離膠配方：30%丙締酷胺溶液 1.7ml;Tris-HCl(1.5M，P冊.8)1.3ml;10%SDS 0. 05ml;10%AP0. 05ml;TEMED0. 002ml;滅菌水補充至 5ml;
[0138] 混勻后立即灌膠，然后加1ml蒸饋水覆蓋，室溫下放置約30min待膠聚合后，用蒸 饋水洗2-3次，再用濾紙吸干。然后制備2ml5%的濃縮膠，配方如下：
[0139]濃縮膠配方：30%丙締酷胺溶液0. 33ml;Tris-HCl(l. 0M，p冊.8)0. 25ml;10%SDS 0. 02ml;10%AP0. 02ml;TEMED0. 002ml;滅菌水補充至 2ml;
[0140] 混勻后立即灌膠，插入樣品梳，避免產(chǎn)生氣泡，待膠凝固后，取出樣品梳，后用蒸饋 水和IX蛋白電泳緩沖液先后沖洗樣品孔。 陽141]S、上樣及電泳 陽142] 將凝膠板裝在電泳裝置上，內(nèi)槽中加滿IX蛋白電泳緩沖液，外槽中IX蛋白電泳 緩沖液應(yīng)超過銷絲，按順序上樣。在末端泳道中加入蛋白質(zhì)質(zhì)量標準蛋白梯度。電泳時藍 色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。 陽14引四、蛋白質(zhì)印跡
[0144] 1.按照上述方法先進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。 陽145] 2.預(yù)先用轉(zhuǎn)印緩沖液浸泡NC膜、濾紙、海棉墊。SDS-PAGE結(jié)束后取出凝膠，去除 濃縮膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒，然后置于轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡15-30min。打開 電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印緩沖液浸泡透的海棉墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的 濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上， 最后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。在電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印 夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷），連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印 夾的NC膜應(yīng)對電泳槽的正極。
[0146] 3.封閉：用1XTBS漂洗一次。加入含5%的無脂奶粉TBS封閉緩沖液，置于振蕩 培養(yǎng)箱中進行封閉； 陽147] 4. -抗雜交：棄封閉液，加入用一抗稀釋液稀釋的一抗（Anti-ASSl antibody圧PR1239引（油170952))雜交溶液，置于4°C雜交過夜，第二天在振蕩培養(yǎng)箱中進 行雜義；
[0148] 5.回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次；
[0149] 6.棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋的二抗（GoatAnti-RabbitIgG，HRP Con化gated(CW0103))雜交溶液，置于振蕩培養(yǎng)箱中進行雜交；
[0150] 7.棄二抗溶液，用TBST洗膜3次； 陽151] 8.E化化學發(fā)光及圖像采集和分析：按照高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒（康為世 紀貨號CW0049B)，具體步驟參照說明書。 陽15引 9. W P -Actin作為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)標準化，W對照組滑膜組織中ASS1作為參照樣 本，計算實驗組中ASS1蛋白的相對表達水平。 陽153] 五、實驗結(jié)果 陽154] 結(jié)果顯示，37例骨性關(guān)節(jié)炎患者組中有13例陽性，24例陰性，9例對照組中有6例 陽性，ASS1蛋白陽性率分別是35. 14%和66. 67%，兩組差異具有統(tǒng)計學意義。進一步對骨 性關(guān)節(jié)炎患者組內(nèi)ASS1蛋白表達和基因甲基化狀態(tài)做相關(guān)性分析，結(jié)果見圖2和表2, 28 例ASS1蛋白表達陰性的患者里有19例都出現(xiàn)甲基化陽性，表明ASS1蛋白表達和基因甲基 化呈負顯著相關(guān)性。
[01巧]表2骨性關(guān)節(jié)炎患者組內(nèi)ASS1蛋白表達和基因甲基化相關(guān)性分析陽巧6]
【主權(quán)項】
1. 一種骨性關(guān)節(jié)炎診療試劑，其特征在于，診療試劑組分包含檢測或降低序列表中SEQ IDNO. 3的CpG島甲基化程度的組分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的診療制劑，其特征在于，診療試劑組分中包含檢測或降低序 列表中SEQIDNO. 3的第166bp處CpG島甲基化程度的組分。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的診療試劑，其特征在于，采用BSP測序法對SEQIDNO. 3的甲 基化程度進行檢測，優(yōu)選采用引物序列為序列表SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5進行BSP測 序檢測。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項所述的診療試劑，其特征在于，采用甲基化特異性PCR 法對甲基化程度進行檢測，優(yōu)選采用引物序列為序列表SEQIDNO. 6到SEQIDNO. 9進行 甲基化特異性PCR法對甲基化程度進行檢測。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的診療試劑，其特征在于，采用下列方法中任意一種或幾種的 組合對甲基化程度進行檢測：甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHSOJi、芯片技術(shù)方法； 所述NaHSO3法包括BSP測序法、聯(lián)合NaHSO3限制性分析法、甲基化特異性PCR、熒光定量法； 所述芯片技術(shù)方法包括甲基化高密度芯片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核苷酸芯片。6. -種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，其特征在于，所述制劑中含有促進ASSl基因的轉(zhuǎn)錄或 表達的試劑或化合物。7. 權(quán)利要求1-5任意一項所述的診療試劑、權(quán)利要求6所述的制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎 診療工具中的應(yīng)用。8. -種檢測ASSl基因的試劑在制備診斷骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，診斷制劑中含有檢測ASSl基因表達量和 /或檢測ASSl基因甲基化程度的試劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，采用下列方式中的一種或幾種檢測ASSl 基因表達量：熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、ELISA法、膠體金法，優(yōu)選采用引物序列為序 列表SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2進行ASSl基因表達量檢測。
【專利摘要】本發(fā)明涉及ASS1甲基化檢測在骨性關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用，更具體的涉及ASS1基因、ASS1基因的甲基化檢測及其在診治骨性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。發(fā)明基于測序結(jié)果分析篩查在骨性關(guān)節(jié)炎患者中基因低表達同時基因呈高甲基化的候選基因ASS1，進一步的實驗驗證基因ASS1在骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中低表達，同時該基因在患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中甲基化程度明顯高于正常組，ASS1蛋白表達和基因甲基化呈負顯著相關(guān)性。本發(fā)明提供了一種新的骨性關(guān)節(jié)炎診治靶點，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
【IPC分類】A61K45/00, A61P29/00, A61P19/02, C12Q1/68
【公開號】CN105200158
【申請?zhí)枴緾N201510753607
【發(fā)明人】林進, 吳志宏, 范彧, 葉偉亮, 楊躍梅, 陳俊, 康艷娜
【申請人】林進
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年11月6日