一種人源抗創(chuàng)傷弧菌溶血素蛋白(vvh)抗體的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種人源抗創(chuàng)傷弧菌溶血素蛋白（WH)抗體 的制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 創(chuàng)傷弧菌是近海海域致病性較為突出的一種人魚共患致病弧菌，天然存在于近海 海水及海生動(dòng)植物中，可經(jīng)胃腸道粘膜或皮膚開放性創(chuàng)口進(jìn)入人體，導(dǎo)致蜂窩織炎、脈毒 性休克、多器官衰竭等嚴(yán)重的感染癥狀，即使用抗生素積極治療，仍有很高的死亡率（> 50% )，因此對(duì)人體的健康乃至生存W及海洋漁業(yè)等都有極大危害。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)創(chuàng)傷弧 菌的治療仍W抗生素傳統(tǒng)治療方法為主，耐藥菌株的出現(xiàn)W及藥物殘留等問題，使得生物 治療新方法的研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)，特別是近年來，W單克隆抗體為基礎(chǔ)的抗感染免疫治療 研究進(jìn)展迅速，也使得針對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗體免疫治療已成為現(xiàn)代生物制藥的重要內(nèi)容。
[0003] 創(chuàng)傷弧菌的致病性與多種毒力因子相關(guān)，其中創(chuàng)傷弧菌溶血素（WH)是一種公 認(rèn)的由創(chuàng)傷弧菌結(jié)構(gòu)基因vvM編碼的致病因子，是創(chuàng)傷弧菌侵襲人體時(shí)釋放至胞外的唯 一的一種胞膜穿孔毒素，可W誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生壞死、調(diào)亡，在致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作 用。目前已研制出針對(duì)WH的檢測(cè)用抗體制劑，針對(duì)創(chuàng)傷弧菌毒素蛋白、非金屬蛋白酶、外 膜蛋白等毒力因子中和性抗體也已問世，可在一定程度上有效治療感染致死量創(chuàng)傷弧菌的 小鼠，提高生存率，且部分抗體疫苗已應(yīng)用于海洋漁業(yè)中魚病的防治，并已取得較好的防治 效果。但迄今運(yùn)些創(chuàng)傷弧菌中和抗體均是鼠源或其它動(dòng)物源性，屬于人體異源蛋白，易使人 體產(chǎn)生異源抗原免疫反應(yīng)，因而限制了其進(jìn)一步在人體內(nèi)的應(yīng)用。而高親和力、高抗菌活性 的人源化抗體的研制則在很大程度上彌補(bǔ)了運(yùn)種缺陷，現(xiàn)已成為未來抗感染生物治療的主 要發(fā)展方向。
[0004] 隧菌體抗體庫(kù)技術(shù)是目前生產(chǎn)全人源化抗體的最主要方法，它能夠?qū)⑷卓贵w基 因展示在隧菌體表面，并在體外模擬抗體免疫系統(tǒng)的選擇作用，對(duì)呈現(xiàn)在隧菌體表面的抗 體在體外用固相化抗原進(jìn)行篩選。隧菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人源抗體制備技術(shù)的重大突破， 即不需要免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合，可利用抗原直接篩選所需基因。利用抗體庫(kù)篩選技術(shù)，目前 已有針對(duì)多種細(xì)菌（如抗肺炎鏈球菌、結(jié)核桿菌、鼠疫桿菌、肺炎克雷伯菌等）及病毒（如 呼吸道冠狀病毒、登革熱病毒等）的ScFv人源單鏈抗體問世，但尚未見到抗創(chuàng)傷弧菌人源 化抗體的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抗創(chuàng)傷弧菌WH的抗體。
[0006] 本發(fā)明提供的抗創(chuàng)傷弧菌WH的抗體包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)；所述重鏈可 變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列1的自氨基末端第135-260位氨基酸殘基，所述輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列1的自氨基末端第1-113位氨基酸殘基。
[0007] 上述抗體中，所述抗創(chuàng)傷弧菌WH的抗體為人源抗創(chuàng)傷弧菌WH的抗體，所述抗創(chuàng) 傷弧菌WH的抗體為單鏈抗體。
[0008] 上述抗體中，所述抗體為如下1)或2)所示的蛋白質(zhì)： 陽(yáng)009] 1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] 2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述抗體的編碼DNA分子。
[0012] 本發(fā)明提供了上述抗體的重鏈可變區(qū)的核巧酸序列為序列表中序列2的第 405-780位核巧酸分子；所述抗體的輕鏈可變區(qū)的核巧酸序列為序列表中序列2的第1-339 位核巧酸分子。 陽(yáng)01引上述編碼DNA分子中，所述編碼DNA分子為如下1)-扣中任一所述的DNA分子：
[0014] 1)其核巧酸序列是序列表中的序列2 ;
[0015] 2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列2限定的DNA分子雜交且編碼上述抗體的DNA 分子；
[0016] 3)與1)的DNA分子具有90%W上的同源性且編碼上述抗體的DNA分子。
[0017] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有上述編碼DNA分子的重組表達(dá)載體或表達(dá)盒或 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0018] 上述抗體在如下a)-d)中任一種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0019]a)制備特異性結(jié)合創(chuàng)傷弧菌VVH的產(chǎn)品；
[0020]b)制備特異性結(jié)合游離的VVH抗原的產(chǎn)品；
[0021] C)制備治療或輔助治療創(chuàng)傷弧菌的產(chǎn)品；
[0022] d)作為創(chuàng)傷弧菌疫苗。
[0023] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種治療或輔助治療抗弧菌感染的產(chǎn)品。
[0024] 本發(fā)明提供的治療或輔助治療抗弧菌感染的產(chǎn)品的活性成分為上述抗體。
[00巧]上述應(yīng)用或上述抗體中，所述產(chǎn)品為藥物。
[00%] 本發(fā)明選擇創(chuàng)傷弧菌向胞外釋放的唯一的細(xì)胞毒素WH為祀抗原，利用天然大容 量人源隧菌體抗體庫(kù)篩選技術(shù)制備的人源抗創(chuàng)傷弧菌WH抗體，其抗體結(jié)構(gòu)與種類與現(xiàn)有 報(bào)道的創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)及治療性抗體不相同，該抗體特點(diǎn)是具有較高的中和創(chuàng)傷弧菌WH的 能力，與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有抗體比較，此抗體為完全人源抗體，從理論上講不會(huì)誘發(fā)明顯過敏反 應(yīng)；且體內(nèi)循環(huán)半衰期短、穿透力強(qiáng)，不會(huì)像抗生素類藥品有殘留污染，在創(chuàng)傷弧菌感染的 治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】 陽(yáng)027] 圖1為不同抗VVH隧菌體抗體與游離抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制率。
[0028] 圖2為抗WH隧菌體抗體的中和活性。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 W31] 下述實(shí)施例中的原始隧菌體抗體庫(kù)在文獻(xiàn)"喬媛媛，王談，陳曉穗，王 欲曉，化冰.大容量隧菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜 志，2004, 24 (3)，194-197.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院"中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放 軍海軍總醫(yī)院獲得。
[0032] 下述實(shí)施例中的BS1365細(xì)胞在文獻(xiàn)"王談，王欲曉，陳曉穗，化冰，劉曉林，用 于大容量隧菌體抗體庫(kù)的表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定，中國(guó)免疫學(xué)雜志，2003, 19 (2)，93-96. 中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院"中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院獲得。
[0033] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌皿2151在文獻(xiàn)"王談，劉群英，化冰，陳宇萍，朱迎春， 陳曉穗，從半合成抗體庫(kù)克隆抗TNF-a人單鏈抗體，免疫學(xué)雜志，1999, 15(4) : 87-89." 中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院獲得。
[0034] 下述實(shí)施例中的用于篩選的WH抗原在文獻(xiàn)"魏杰，郭建巍，馬驢等.創(chuàng)傷弧菌 溶血素基因的高效表達(dá)與鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 29(14) : 1249-1252."和文獻(xiàn)"付 凱飛，馬驢，郭建巍等.抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立及初步鑒定.細(xì)胞與分 子免疫學(xué)雜志，2012, 28 (3) : 279-281."中公開過，公眾可W從海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科獲得。
[0035] 下述實(shí)施例中的超級(jí)營(yíng)養(yǎng)肉湯（Superbroth,SB)培養(yǎng)液的溶劑為水，溶質(zhì)及其在 SB培養(yǎng)液中的濃度為：膜蛋白腺30g/l，酵母粉20g/l，3-(N-嗎嘟代）丙橫酸lOg/L。
[0036]實(shí)施例1、抗VVH抗體的制備方法 陽(yáng)037] -、大容量人源隧菌體抗體庫(kù)的制備
[0038]參考文獻(xiàn)"SblatteroD,Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol,2000;18:74. "中 的方法制備大容量人源隧菌體抗體庫(kù)，具體步驟如下：
[0039] 1、從原始隧菌體抗體庫(kù)中取出7 X l〇i2c化（克隆形成單位）的隧菌體顆粒超感染 BS1365細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection,M0I為100/1，具體步驟參照文獻(xiàn)"王 談，王欲曉，陳曉穗，化冰，劉曉林.用于大容量隧菌體抗體庫(kù)的表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒 定，中國(guó)免疫學(xué)雜志，2003, 19 (2) ,93-96."中的方法，37°C水浴lh，W使多副本載體進(jìn)入同 一細(xì)胞，通過cre-loxp介導(dǎo)的定位重組使同一細(xì)胞內(nèi)不同載體之間的輕、重鏈隨機(jī)交換配 對(duì)，得到感染體系。 W40] 2、向上述步驟1的感染體系中加入含氨節(jié)青霉素（lOOug/mU的2XYT培養(yǎng)液（溶 劑為水，溶質(zhì)及其在培養(yǎng)液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：蛋白腺1.6%的、酵母提取物1%的和氯化鋼 0. 5% )至400血，37°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0D= 0. 5)。 陽(yáng)0川 3、向步驟2培養(yǎng)后的感染體系中加入5ml輔助病毒VCSM13(p化=1.7Xl〇i2) (MerckST200251)，30°C低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，次日離屯、上清，陽(yáng)G8000(購(gòu)自Promege公 司）回收沉淀，并測(cè)定隧菌體滴度，再WM0I《1的比例感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的化1-Blue菌 (1000ml) (Stratagen,貨號(hào)：200228)，37°C靜止 30min。
[0042] 4、取10y1鋪于含氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)盤計(jì)算庫(kù)容，加入氨節(jié)青霉素使其終濃度為 lOOg/ml，再加入10ml輔助隧菌體VCSM13(pfu= 1. 7X1〇i2)，30°C低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，次日 回收上清，PEG8000回收沉淀，獲得大容量重組隧菌體抗體工作庫(kù)（大容量人源隧菌體抗體 庫(kù)），并計(jì)算大容量重組隧菌體抗體工作庫(kù)的庫(kù)容和滴度。
[0043] 結(jié)果表明：大容量人源隧菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容為7X1〇1°，滴度為3Xl〇i2c化/ml。 W44] 二抗WH隧菌體抗體的篩選、制備及ELISA檢測(cè) W45] 1、抗VVH隧菌體抗體的篩選
[0046] 抗VVH隧菌體抗體的篩選參照文獻(xiàn)"王談，劉群英，化冰等.從人源性隧菌體抗體 庫(kù)分離出1株含有異常序列的抗皿sAgF油克隆.中國(guó)免疫學(xué)雜志，1998,14(1): 115-119." 和文獻(xiàn)"王欲曉，喬媛媛，周麗君等.從大容量抗體庫(kù)中篩選抗TNF-a人單鏈抗體.細(xì)胞與 分子生物學(xué)雜志，2008, 24巧）：878-880."中的方法。具體步驟如下：
[0047](1)將VVH抗原用0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液腫9. 6)稀釋至50 y g/ml，得到VVH 抗原溶液。
[0048] (2)取1mlWH抗原溶液包被免疫管，4°C過夜，用2. 5%的脫脂奶粉封閉化，加入 1ml上述步驟一制備的大容量人源隧菌體抗體庫(kù)（約3Xl〇i2c化），37°C解育化。 W例 做用PBST將步驟似的產(chǎn)物洗涂15次（第2-4輪洗涂20次W上），蒸饋水洗 涂1次，然后加入1ml新鮮的化1-Blue菌直接感染，37°C解育15min，再轉(zhuǎn)入10ml超級(jí)營(yíng)養(yǎng) 肉湯（Superbroth,SB)培養(yǎng)液（含20yg/ml氨節(jié)青霉素）中。
[0050] (4)向步驟做的產(chǎn)物中加入1ml甘氨酸洗脫緩沖液（0.Imol/L肥1，甘氨酸調(diào)抑 值至2.