illus sp. )DY26-020的菌落形態(tài)。
[0020] 圖2為芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_020的發(fā)酵上清液對不同植物致病真菌的 抑菌效果圖。在圖2中：A :灰霉菌；B :宛氏擬青霉；C :核盤菌；D :綠色木霉；E :立枯絲核菌； F :長柄鏈格孢；G :膠孢炭疽菌；H :互生鏈格孢；I :鐮刀菌；J :香蕉炭疽菌。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0022] 實施例1 :芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_020的分離篩選
[0023] 本發(fā)明涉及芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-020來源于本申請人從中國大洋第26 次科學(xué)考查所采集的沉積物樣品中篩選獲得。該菌在LB培養(yǎng)基上生長，28°C培養(yǎng)24h后， 菌體呈白色，菌落較小，菌落邊緣不規(guī)則，見圖1。
[0024] 實施例2 :芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_020菌種鑒定
[0025]利用 16S rDNA 通用引物 27F 和 1492R(27F :AGAGTITGATCCTGGCTCAT ;1492R : ACGGCTACCTTGTTACGACTT)對大洋來源菌株 DY26-02016S rDNA 序列進(jìn)行擴增。以 DY26-020 總DNA為PCR擴增模板，在Eppendorf PCR擴增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 °C 變性lmin ;55°C退火lmin ;72°C延伸1. 5min，30個循環(huán)。擴增序列經(jīng)測序公司測序 后，獲得該菌株16S rDNA序列。將該序列通過與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI) GeneBank中核酸數(shù)據(jù)（http://ncbi.nlm. nih.gov/blast)進(jìn)行對比分析。比對結(jié)果顯 不，DY26-02016S rDNA 序列與 Bacillus amyloliquefaciens(JQ664685. 1)、Bacillus amyloliquefaciens(JQ062537. 1)、Bacillus amyloliquefaciens(JF899253. 1)等菌株的 序列相似性為99%，即芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26-020與芽孢桿菌同源，因此，將其命 名為芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-020。
[0026] 實施例3 :植物致病真菌抗菌譜的測定
[0027] 采用紙片法測定芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_020對10種植物致病真菌的抑制 活性。用無菌打孔器將受試致病真菌制成菌塊，用牙簽挑取一菌塊接種于馬鈴薯固體培養(yǎng) 基平板中央，28°C的條件下培養(yǎng)。待受試致病真菌菌絲體擴散生長后，將滅菌的雙層濾紙片 (直徑6mm)放置于菌塊四周，濾紙片距離菌絲邊緣約lcm。在每個濾紙片上加50 iiL的無 菌發(fā)酵上清液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，通過與對照組比較，觀測菌絲體的生長是否會受到抑制，若受 試致病真菌的菌絲體受到抑制，菌絲體會形成月牙型或者線型邊緣。結(jié)果如圖2所示，芽孢 桿菌（Bacillus sp. )DY26-020發(fā)酵上清液對10種受試植物致病真菌具有抑制活性，分別 為：鐮刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、互生鏈 格孢、灰霉菌、膠孢炭疽菌。
[0028] 實施例4 :油菜菌核病（核盤菌感染引起）的生物防治盆栽試驗
[0029]油菜菌核病菌在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后制成直徑5mm的菌碟，留 待備用。于油菜主莖開花期，在葉片和莖桿上接種油菜菌核病菌菌碟，接種后的盆缽置于 25°C，相對濕度80%的環(huán)境下。油菜盛花后期，芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-020發(fā)酵上 清液利用小型噴霧器（500mL)進(jìn)行均勻噴霧，孔徑〈7_，藥劑不留殘液。3天后調(diào)查葉片調(diào) 查病斑直徑（d)，計算病斑面積，病斑面積=Jr X (d/2)2,莖桿量取病斑長度，按下式計算防 效：
[00301
[0031] 計算結(jié)果表明，芽孢桿菌（Baci 1 lus sp. ) DY26-020對油菜菌核病防效達(dá)到 65. 5%〇〇
[0032] 實施例5:小麥赤霉?。ㄧ牭毒腥疽穑┑纳锓乐闻柙栽囼?br>[0033] 鐮刀菌制成106個/mL的孢子懸浮液，于小麥揚花期，將10 y L孢子懸浮液滴注入 麥穗中部的小花內(nèi)。24h后，芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26-020發(fā)酵上清液利用小型噴霧 器（500mL)進(jìn)行均勻噴霧防治，孔徑<7mm，藥劑不留殘液。乳熟后期逐穗記載嚴(yán)重度，分級， 計算病情指數(shù)、防治效果。
[0034] 分級方法：
[0035] 0級：全穗無??；
[0036] 1級：感病穗面積占全穗面積的四分之一以下；
[0037] 3級：感病穗面積占全穗面積的四分之一至二分之一；
[0038] 5級：感病穗面積占全穗面積的二分之一至四分之三以下；
[0039] 7級：感病穗面積占全穗面積的四分之三以上。
[0040] 藥效計算方法如下：
[0041]
[0042]
[0043] 計算結(jié)果表明，芽孢桿菌（Bacillus sp. )DY26_020小麥赤霉病防效達(dá)到67.9%。
【主權(quán)項】
1. 芽孢桿菌（Bacillussp. )DY26-020,已于2015年6月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCCNO:M2015409。2. 如權(quán)利要求1所述芽孢桿菌（Bacillussp. )DY26-020,其特征在于16SrDNA部分 序列如下：3. 如權(quán)利要求1所述芽孢桿菌（Bacillussp. )DY26-020在制備防治植物致病真菌發(fā) 酵上清液中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述防治植物致病真菌發(fā)酵上清液的使用方法 如下：將防治植物致病真菌發(fā)酵上清液直接或稀釋后噴灑在植物上。5. 如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述防治植物致病真菌發(fā)酵上清液的制備方法 如下：首先將芽孢桿菌（Bacillussp.)DY26-020在含有5mLLB培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行活化 培養(yǎng)，然后將活化的菌株接種到500mLLB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后離心除去菌體，得 到防治植物致病真菌發(fā)酵上清液。6. 如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于所述LB培養(yǎng)基的組成如下：氯化鈉10g/L， 胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，121°C高滅壓菌20min。7. 如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于所述離心除去菌體是在10000r/min下離心 15 ~20min〇8. 如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于所述菌株活化培養(yǎng)時間為12~24h，發(fā)酵 培養(yǎng)時間為48~72h。9. 如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于所述細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)酵的溫度為28~30°C，發(fā) 酵培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為180~220r/min。10. 如權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于所述植物致病真菌包括但不限于鐮刀菌、 香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、互生鏈格孢、灰霉菌 和膠孢炭疽菌。
【專利摘要】芽孢桿菌DY26-020及其在制備防治植物致病真菌發(fā)酵上清液中的應(yīng)用，涉及芽孢桿菌屬。所述芽孢桿菌(Bacillus？sp.)DY26-020的保藏編號為CCTCC？NO：M？2015409。芽孢桿菌DY26-020可用于制備防治植物致病真菌發(fā)酵上清液。所述芽孢桿菌防治的植物致病真菌如下：鐮刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、互生鏈格孢、灰霉菌、膠孢炭疽菌。其在油菜菌核病菌防治和小麥赤霉病防治的盆栽試驗中有較好的生物防治效果，防效可以達(dá)到65％以上。芽孢桿菌DY26-020發(fā)酵上清液的制備工藝簡單，抑真菌譜廣，生防效果好。CCTCC NO：M 201540920150627
【IPC分類】C12R1/07, A01P3/00, A01N63/02, C12N1/20
【公開號】CN105132338
【申請?zhí)枴緾N201510666284
【發(fā)明人】陳新華, 吳小君, 郭文斌
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所, 中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年10月15日