勻，40°C反應(yīng)8-14小時。反應(yīng)完成后，準(zhǔn)備純化cRNA。
[0052] 4、cRNA 反轉(zhuǎn)錄
[0053] 1) cRNA 反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA
[0054] 取cRNA純化產(chǎn)物5 y g，調(diào)整體積至7. 5 y L，加入到0. 2mL無核酸酶離心管中，并 加入4 y L Random Primer，混勾，65°C 5分鐘，冰浴5分鐘。
[0055] 配制cRNA反轉(zhuǎn)錄Master Mix(下列表6所示為單個反應(yīng)體系用量），輕柔混勾，短 暫離心將溶液收集于管底。向上述步驟后每個樣品管中加入8.5yL Master Mix。
[0056]表6.cRNA 反轉(zhuǎn)錄Master Mix :
[0057]
[0058] 輕柔混勻，短暫離心后25°C反應(yīng)10分鐘，37°C反應(yīng)1. 5小時。
[0059]反應(yīng)結(jié)束后加入TerminateSolution5yL，混勾。
[0060] 65 °C反應(yīng)10分鐘，室溫靜置5分鐘。
[0061] 加入NeutralizeSolution1uL，混勾，準(zhǔn)備純化。
[0062] 2)純化、定量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
[0063]使用胸cleospin?ExtractII (MN公司，Cat.No. 740609. 250)試劑盒，或者其他類似 產(chǎn)品進(jìn)行純化。
[0064] 使用紫外分光光度計(jì)定量純化后的cDNA產(chǎn)物，cDNA在260nm處有特征吸收峰 (10D260 = 40yg/yL)。
[0065] (b)熒光標(biāo)記上述cDNA樣品，具體如下：
[0066] 1、標(biāo)記反應(yīng)
[0067] 將反轉(zhuǎn)錄后純化得到的cDNA產(chǎn)物體積濃縮至14 y L，加入4 y L Random Primer混 勻，短暫離心后95°C變性3分鐘，冰浴5分鐘。
[0068] 依次加入下列表7中試劑，使用移液器吹打2-3次混勻，短暫離心后37°C反應(yīng)1. 5 小時，70°C反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，準(zhǔn)備純化。
[0069] 表7.添加試劑：
[0070]
[0071] 2、純化、定量標(biāo)記產(chǎn)物
[0072]使用Nucleospiti? Extract II (MN 公司，Cat. No. 740609. 250)試劑盒對標(biāo)記產(chǎn)物純 化。
[0073] 純化后產(chǎn)物采用NanoDrop定量。
[0074] 標(biāo)記產(chǎn)物中核酸在260nm處有特征吸收峰（10D260 = 50 yg/yL)。
[0075] (c)將熒光標(biāo)記后的cDNA樣品與所述基因芯片雜交，具體如下：
[0076] 1、配制雜交體系（如表8)
[0077] 取一只0. 5mL無核酸酶的Ep管，依次加入以下試劑。
[0078] 表8.雜交液配制表（配制100 y L雜交液）：
[0079]
[0080] 用加樣器抽吸混勻，置于冰上備用。
[0081] 2、每張芯片雜交體系為81. 6yL，包括40yL熒光標(biāo)記的cDNA和41. 6yL新配制 的雜交緩沖液。將純化后的已經(jīng)標(biāo)記有Cy3和Cy5熒光的DNA樣品分別加入Nuclease-free Water補(bǔ)足體積至20yL(注：如果體積已經(jīng)超過20yL，可以使用旋轉(zhuǎn)濃縮儀進(jìn)行濃縮）。 并加入41. 6yL混合配制的雜交液，輕微離心并用加樣器混勻。
[0082] 3、將上面樣品置于95°C孵育3min，然后放置于冰上2min備用。
[0083] 4、取芯片雜交盒，放入一片大小合適的濾紙片，加入100-150 yL去離子水以保持 必要的濕度。
[0084] 5、將已經(jīng)處于室溫的芯片拆封，帶有條形碼的一面向上置于雜交盒內(nèi)。在芯片上 加入81. 6 y L的含有熒光標(biāo)記cDNA的雜交液，然后小心地放置蓋片（LifterSlip?蓋片， Themo公司），避免產(chǎn)生氣泡。
[0085] 6、將雜交盒組裝好，放置于雜交儀上，一般42°C雜交過夜。對博奧生物芯片建議使 用博奧生產(chǎn)的晶芯? BioMixerTM II芯片雜交儀（Cat. No. 120030)，以獲得良好的雜交均勻 性；對其他芯片類型采用相應(yīng)的雜交儀。
[0086] (d)掃描檢測基因芯片的雜交信號，獲得結(jié)果，具體如下：
[0087] 1、雜交結(jié)束后，取出芯片，先在42°C左右含0. 2%SDS，2XSSC的洗液I中洗5min， 而后在室溫的0. 2XSSC的洗液II中洗5min，玻片甩干后即可用于掃描。
[0088] 2、使用LuxScan-lOKA芯片掃描儀對清洗后的芯片進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。
[0089] 3、數(shù)據(jù)提取及分析
[0090] 提取數(shù)據(jù)使用采用LuxScan 3. 0圖像分析軟件（CapitalBio公司）對芯片圖像進(jìn) 行分析，結(jié)果顯示在發(fā)明者選取的8種解毒代謝相關(guān)基因中，有Lysozyme 3、ARSB、MEGF、 CYP1A1、VTG、C0L4六種基因在四溴雙酚A脅迫下表達(dá)量有顯著上調(diào)；而GPXUS0D兩種基因 表達(dá)量有顯著下調(diào)，如下列表9所示。
[0091] 表9.實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析：
[0092]
[0093]
[0094] 綜上，利用基因芯片技術(shù)可尚效快速判斷t節(jié)孔扇貝體內(nèi)相關(guān)的八種解毒代謝基因 的表達(dá)量變化情況，為判讀某水域四溴雙酚A污染情況提供了一種高效、穩(wěn)定的檢測技術(shù)， 尤其對于要求多地區(qū)同時檢測的監(jiān)測意義顯得尤為重大。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的基因芯片，其特征在于包括固相載體和 固定在該固相載體上的8種寡核苷酸探針，所述8種寡核苷酸探針取自櫛孔扇貝特定的8 個基因序列，所述的8種寡核苷酸探針是SEQ ID NO. 1~8所示的核苷酸序列。2. 如權(quán)利要求1所述的一種檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的基因芯片，其特征 在于所述的固相載體選自載玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯。3. 利用權(quán)利要求1所述的基因芯片檢測四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的方法，包括 (a) f節(jié)孔扇貝cDNA樣品的制備； (b) 灰光標(biāo)記上述cDNA樣品； 其特征在于還包括以下步驟： (c) 將熒光標(biāo)記后的cDNA樣品與所述基因芯片雜交； (d) 掃描檢測基因芯片的雜交信號，獲得結(jié)果。若有基因差異表達(dá)，表示該櫛孔扇貝可 能受到四溴雙酸A脅迫，繼而進(jìn)行進(jìn)一步定量檢測。
【專利摘要】一種檢測四溴雙酚A毒性效應(yīng)的櫛孔扇貝基因芯片，包括固定在固相載體上的8種寡核苷酸探針，所述8種寡核苷酸探針取自櫛孔扇貝特定的8個基因序列，所述的8種寡核苷酸探針是SEQ？ID？NO.1～8所示的核苷酸序列。可用于批量檢測櫛孔扇貝解毒代謝的8個相關(guān)基因在四溴雙酚A脅迫下的基因差異表達(dá)相關(guān)信息。其檢測方法包括櫛孔扇貝cDNA樣品的制備；熒光標(biāo)記上述cDNA樣品；將熒光標(biāo)記后的cDNA樣品與所述基因芯片雜交；掃描檢測基因芯片的雜交信號，獲得結(jié)果。應(yīng)用該芯片在可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)信息的高通量檢測的同時，還具有且操作簡單方便，檢測結(jié)果高效可靠，可節(jié)省大量人力、物力和財(cái)力等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, C40B40/06
【公開號】CN105113020
【申請?zhí)枴緾N201510578021
【發(fā)明人】潘魯青, 苗晶晶, 蔡月鳳, 王虹丹
【申請人】中國海洋大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年9月11日