41] 其中，A:TMV粒體（對(duì)照）B:與發(fā)酵液混和后的TMV粒體；
[0042] 圖6為本發(fā)明菌株L1的胞內(nèi)蛋白粗提液的拮抗活性效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0044] 實(shí)施例1防治TMV拮抗內(nèi)生菌菌株L1的篩選
[0045] 從山東省即墨市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)基地取TMV抗性品種煙株，從 煙株葉片用無菌刀切取1. 〇g的小塊，用70%乙醇和1%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒。以組織 表面消毒后的最后一次沖洗無菌水作為空白對(duì)照，以此檢測(cè)表面消毒效果。在無菌操作臺(tái) 中，將消毒后的樣品放入滅菌的研缽中研磨。將研磨液用無菌水稀釋成1X10 4，1X105， 1X106,1X107,1X108的濃度。用移液槍吸取100yL各稀釋液研磨液涂布于富集培養(yǎng)基 平板上，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，挑選不同單菌落再次劃線純化3次，既得本發(fā)明菌 株，-80°C甘油冷凍保存。
[0046] 實(shí)施例2本發(fā)明菌株L1的鑒定
[0047] 2. 1本發(fā)明菌株L1的生理生化鑒定
[0048] 菌株L1在LB培養(yǎng)基平板劃線后生長狀態(tài)見圖1。
[0049] 菌落乳白色不透明，邊緣整齊，表面光滑，無水溶性色素。
[0050] 菌株L1在透射電鏡下的菌體形態(tài)見圖2。
[0051]負(fù)染標(biāo)本制作，取一環(huán)生長于LB培養(yǎng)基平板上的糞產(chǎn)堿菌，用無菌生理鹽水制成 菌懸液，加一滴到銅網(wǎng)載膜上，1 %磷鎢酸負(fù)染。
[0052] 負(fù)染標(biāo)本用H-600透射電鏡，在加速電壓80KV下觀察。臨界點(diǎn)觀察。
[0053] 菌株L1菌體多以單個(gè)個(gè)體存在，菌體呈短桿狀或球桿狀，有莢膜，周生鞭毛。
[0054] 利用非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管對(duì)L1進(jìn)行生化鑒定。菌株L1的生化鑒定結(jié)果見表 1。將鑒定結(jié)果在非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定編碼手冊(cè)上進(jìn)行比對(duì)，菌株L1與糞產(chǎn)堿菌的相似性 為 0.4410。
[0055] 表1本發(fā)明囷株L1生化鑒走結(jié)果
[0056]
[0057] 2. 2本發(fā)明菌株L1的分子鑒定
[0058] 參照文獻(xiàn)（林萬明主編細(xì)菌分子遺傳學(xué)分類鑒定方法[M].上海，上海科學(xué)技術(shù)出 版社1990)方法提取總體DNA，利用引物27F/1492R，參照（C.W.迪芬巴赫，G.S.德維克斯勒 著，黃培堂等譯.PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南[M]，北京科學(xué)技術(shù)出版社，2000)方法進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增后測(cè)定該片段序列（PCR產(chǎn)物由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司測(cè)序）。
[0059]測(cè)得菌株L1 序列長度為 1425bp。在GenBank(www.ncbi.nlm.nlh.gov)網(wǎng)站 上應(yīng)用BLAST軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌株L1測(cè)得的序列與糞產(chǎn)堿菌16SrDNA部分序列同 源性達(dá)99%，同時(shí)應(yīng)用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3)，發(fā)現(xiàn)菌株L1與糞產(chǎn)堿菌 (Alcaligenesfaecalis)遺傳距離最近。
[0060] 綜合生理生化鑒定及ITS序列分子鑒定結(jié)果，確定本發(fā)明菌株L1為糞產(chǎn)堿菌 (Alcaligenesfaecalis)〇
[0061] 實(shí)施例3本發(fā)明菌株L1對(duì)煙草普通花葉病毒病的抑制作用
[0062] 3-1發(fā)酵液的制備：挑取LB培養(yǎng)基平板上生長良好的單一菌落接種到LB液體培 養(yǎng)基中，于28°(：，180印111，培養(yǎng)2411進(jìn)行活化。然后將活化后的菌液以2%的接種量接入1^ 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即可得到發(fā)酵液。培養(yǎng)條件為：溫度28°C，pH7.0,時(shí)間22h， 轉(zhuǎn)速 180rpm。
[0063] 3-2檢測(cè)方法：利用接種枯斑寄主三生-NN煙的生物學(xué)測(cè)定方法，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)煙 草普通花葉病毒病（TMV)的抑制作用。取充分發(fā)病的TMV煙草上部嫩葉，用無菌研缽研磨成 勻漿，用滅菌后的磷酸鹽緩沖液（PH7.0)按1 : 80比例稀釋。選取長勢(shì)一致的健康的4-6 葉期枯斑寄主三生-NN煙進(jìn)行摩擦接種。左半葉接種LB液體培養(yǎng)基與病毒等體積混和液作 為對(duì)照，右半葉接種發(fā)酵液與病毒等體積混和液作為處理（混合時(shí)間為30min)，接種lOmin 后立即用水噴灑葉面。每處理接種3-4個(gè)葉片，重復(fù)3次，3d后觀察結(jié)果，計(jì)算抑制率，結(jié)果 見表2,并結(jié)合參見如圖4。
[0064] 與TMV作用方式：設(shè)預(yù)防作用（12h)，治療作用（12h)和鈍化作用（30min)三個(gè)處 理。
[0065] 枯斑抑制率計(jì)算公式：
[0066]
[0067] 表2本發(fā)明菌株L1發(fā)酵液對(duì)煙草普通花葉病毒的抑制作用
[0068]
[0069]由表2可知，菌株L1發(fā)酵液對(duì)于TMV的鈍化作用最好，其枯斑抑制率為82. 81 %， 其次為預(yù)防作用，枯斑抑制率為34. 58 %，再次為治療作用，枯斑抑制率為21. 81 %。
[0070] 實(shí)例4透視電鏡下觀察菌株L1發(fā)酵液對(duì)TMV病毒粒體的影響
[0071] (1)TMV粒體的粗提純
[0072] 參照PEG法（胡偉貞等，1989)提純TMV粒體，具體操作步驟如下：
[0073] TMV活體毒源葉片80g，加入0.2M磷酸鹽緩沖液（pH7. 0)，在無菌研缽中將葉片充 分研磨至勾衆(zhòng)，尼龍紗布過濾后，lOOOrpm離心lOmin，保留上清液；
[0074]上清液60°C，水浴加熱lOmin，7000rpm離心5min，棄去沉淀；
[0075] 上清液加入4%PEG6000 (0? 1MNaCl)，邊加邊攪拌，4°C靜置過夜；
[0076] 4°C下，7000rpm離心 20min，棄上清液；
[0077] 沉淀加如勻漿量的1/10 (V/V)量的0. 01M磷酸鹽緩沖液（pH7. 0)，4°C懸浮2. 5h;
[0078] 4°C下，lOOOOrpm離心lOmin，棄沉淀；
[0079] 所得上清液為TMV提純病毒。
[0080] (2)負(fù)染法電鏡樣品的制備與觀察
[0081 ] 將發(fā)酵液與等體積的TMV提純病毒混合，室溫下孵育30min，用無菌水與TMV提純 病毒等體積混合，作空白對(duì)照。
[0082] 用帶膜樣品載網(wǎng)膜面向下吸附3min左右，用一片干凈濾紙從網(wǎng)邊吸去液體；
[0083] 稍干后用鑷子將載膜網(wǎng)轉(zhuǎn)移到磷鎢酸（2%，pH6. 7)中，染色l-2min，取出后用濾 紙吸干染液，放在墊有濾紙的平皿中，干燥；
[0084] 在H-600透射電鏡下，觀察TMV病毒粒體的形態(tài)。
[0085]TMV病毒粒體形態(tài)見圖5,在透射電鏡下觀察，病毒粒體呈桿狀，病毒粒體完整，排 列相對(duì)集中，長度在400-500nm左右；觀察發(fā)現(xiàn)，菌株L1發(fā)酵液與病毒粒體的混合30min 后，TMV粒體排列分散，部分粒體發(fā)生斷裂。
[0086] 實(shí)施例5本發(fā)明菌株L1的胞內(nèi)粗提蛋白抗TMV活性檢測(cè)。
[0087] 將實(shí)施例3中發(fā)酵液經(jīng)8000rpm離心lOmin，沉淀加0? 1MPBS洗滌3次，4°C， 8000rpm離心lOmin。沉淀溶解在0. 1MPBS中，經(jīng)超聲破碎儀破碎后，4°C，11000rpm離心 lOmin。上清液過0. 22ym濾膜，緩慢加入4倍于上清液體積的飽和硫酸銨溶液，4°C靜置過 夜。液體在4°C下，8000rpm離心20min，沉淀用少量體積的PBS-疊氮化鈉溶液溶解。然后 置于截留分子量為8000的透析袋中，透析48h，每隔4h更換透析緩沖液一次（去離子水）， 以徹底除去硫酸氨。透析袋內(nèi)物質(zhì)在260-280nm紫外光附近具有吸收峰，因此可以初步判 斷終獲得是胞內(nèi)蛋白粗提液。
[0088] 以上述胞內(nèi)蛋白粗提液與80倍病毒汁液均勻混合30min，以0. 1MPBS與病毒汁液 混合為對(duì)照，半葉法接種到枯斑寄主三生-NN煙上，每處理接種3-4個(gè)葉片，重復(fù)3次，3d 后觀察結(jié)果，計(jì)算抑制率，結(jié)果見表3,并結(jié)合參見如圖6。
[0089] 表3本發(fā)明菌株L1胞內(nèi)蛋白粗提液對(duì)煙草普通花葉病毒的抑制作用
[0090]
[0091] 由表3可知，菌株L1粗蛋白液的預(yù)防作用、治療作用和鈍化作用與發(fā)酵液相比均 有所提高，三者的枯斑抑制率分別為66. 42%，29. 26%和87. 84%。說明胞內(nèi)蛋白經(jīng)過初步 提取后，可以有效的預(yù)防和鈍化TMV，據(jù)此可以初步確定本發(fā)明菌株L1抗TMV有效成分為胞 內(nèi)蛋白。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種煙草普通花葉病毒生防內(nèi)生菌奠產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis)菌株，菌株 代號(hào)為L1，該菌株于2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 9758。2. 如權(quán)利要求1所述菌株在防治煙草普通花葉病毒中的應(yīng)用。3. -種菌株Ll發(fā)酵液，其制備方法為： 1) 挑取培養(yǎng)基平板上生長良好的菌株Ll的單一菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活 化，于 28°C，180rpm，培養(yǎng) 24h ; 2) 將活化后的菌液以2%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液， 培養(yǎng)條件為：溫度28°C，pH 7. 0,時(shí)間22h，轉(zhuǎn)速180rpm。4. 如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液，其特征在于：可用于提取菌株LI胞內(nèi)對(duì)煙草普通花葉 病毒有防治作用的蛋白粗提液，方法如下： 1) 上述發(fā)酵液經(jīng)8000rpm離心10min，沉淀加0.1 M PBS洗滌3次，然后于4°C，8000rpm 離心10min ; 2) 沉淀溶解在0.1 M PBS中，經(jīng)超聲破碎儀破碎后，4°C，IlOOOrpm離心10min。上清液 過0. 22 y m濾膜，緩慢加入4倍于上清液體積的飽和硫酸銨，4°C靜置過夜。； 3) 液體在4°C下，8000rpm離心20min，沉淀用少量體積的PBS-疊氮化鈉溶液溶解。然 后置于分子量為SOOODa的透析袋中，透析48h，每隔4h更換透析緩沖液一次（去離子水）， 以徹底除去硫酸氨，最終獲得胞內(nèi)蛋白粗提液。5. 如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液在煙草普通花葉病毒病防治中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求4所述的胞內(nèi)蛋白粗提液在煙草普通花葉病毒防治中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草普通花葉病毒生防內(nèi)生菌糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes？faecalis)菌株，菌株代號(hào)為L1，該菌株于2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC？No.9758。該菌株能夠抑制煙草普通花葉病毒(Tobacco？mosaic？virus)的侵染，生防實(shí)驗(yàn)表明能夠防治煙草普通花葉病毒。同時(shí)本發(fā)明還同時(shí)提取該菌株胞內(nèi)對(duì)煙草普通花葉病毒有防治作用的蛋白粗提液，在煙草普通花葉病毒防治方面，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。CGMCC No.975820141013
【IPC分類】A01N63/00, C12N1/20, C12R1/05, A01P1/00, A01N63/02
【公開號(hào)】CN105112315
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510267576
【發(fā)明人】戰(zhàn)徊旭, 王鳳龍, 申莉莉, 楊金廣, 錢玉梅, 陳德鑫, 劉偉, 劉旭
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年5月25日