一種煙草普通花葉病毒生防內(nèi)生菌糞產(chǎn)堿菌菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種煙草普通花葉病毒生防內(nèi)生菌糞產(chǎn)堿菌菌 株，具體涉及一種奠產(chǎn)堿菌（Alcaligenesfaecalis)Ll菌株，同時(shí)涉及由該菌株中得到的 胞內(nèi)粗蛋白成分的方法及在煙草普通花葉病毒防治方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國是煙草種植大國，煙草種植面積及產(chǎn)量位居世界第一。同時(shí)，煙草也是我國的 主要經(jīng)濟(jì)作物之一，在全國20多個(gè)省區(qū)均有種植，云南省、貴州省和四川省是我國煙草種 植大省。
[0003] 然而，各種煙草病蟲害的發(fā)生、流行，在降低煙草的產(chǎn)量與質(zhì)量的同時(shí)，也造成巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，煙草病毒病因其危害嚴(yán)重，防治難度大，被喻為煙草的"癌癥"。自20 世紀(jì)50年代以來，煙草病毒病先后在世界各煙草主產(chǎn)區(qū)爆發(fā)流行，引起各產(chǎn)煙國的廣泛關(guān) 注。目前，病毒病已成為我國煙草生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一，且呈現(xiàn)出逐年加重的發(fā)生趨 勢。2010-2014年進(jìn)行的國家煙草專賣局資助科研項(xiàng)目"全國煙草有害生物調(diào)查研究"，查 明引起我國煙草病毒病的病毒共有23種，病毒種類較1989-1991年進(jìn)行的"全國煙草侵染 性病害調(diào)查研究"的16種煙草病毒病的調(diào)查結(jié)果有了進(jìn)一步的增加。其中，煙草普通花葉 病毒（TMV)、煙草黃瓜花葉病毒（CMV)、馬鈴薯Y病毒（PVY)、煙草蝕紋病毒（TEV)，仍然是發(fā) 生普遍，危害嚴(yán)重的煙草病毒病。由于煙草病毒病目前尚無有效的防治措施，其造成的經(jīng)濟(jì) 損失已經(jīng)大大超過煙草真菌性病害。2000年僅河南煙區(qū)，煙草病毒病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失 就超過4億元人民幣，全世界范圍內(nèi)，每年因煙草花葉病毒病產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失更是多達(dá)1億 多美兀。
[0004] 煙草普通花葉病毒（TMV)是煙草花葉病毒屬（Tobamovirus)的代表成員，也 是煙草生產(chǎn)上最主要的病毒病害。TMV是一種RNA病毒，病毒粒體呈直桿狀，大小為 300nmX18nm。病毒粒體相對(duì)分子質(zhì)量3. 9X107,沉降系數(shù)為185~186S，等電點(diǎn)pH3. 4， 核酸含量5%，沉降系數(shù)30S。煙草普通花葉病毒增殖的最適溫度是28~30°C。其毒力和 抗逆性都很強(qiáng)，含病毒的新鮮汁液稀釋到100萬倍仍有致病力，在汁液中病毒的鈍化溫度 為75°C、40d，或82°C、24h，或93°C、lOmin。干病葉120°C處理30min后仍具有侵染能力，在 140°C下處理30min才會(huì)完全失去活力。TMV寄主范圍極廣，可以侵染30科310種以上植 物。除侵染煙草外，還常侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科作物，Thomberry則列出了煙 草普通花葉病毒的350多種寄主植物。
[0005] 煙草普通花葉病毒主要通過汁液摩擦傳播，如通過打頂、抹杈、施藥等田間農(nóng)事操 作過程中人為的汁液摩擦傳播、機(jī)械摩擦傳播，也可以通過田間病殘?bào)w在土壤中傳播。當(dāng) 病毒汁液達(dá)到葉片表面時(shí)，機(jī)械擦傷使得煙草葉片角質(zhì)層出現(xiàn)微傷，病毒粒體通過該微傷 口接觸煙草葉片表皮細(xì)胞的外壁胞質(zhì)，進(jìn)而通過外壁胞質(zhì)連絲轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器受體 上，病毒就可以復(fù)制增殖。煙草感染TMV后，先在新葉上產(chǎn)生"脈明"，即沿葉脈組織變成淺 綠色，對(duì)光看呈半透明狀，然后逐漸蔓延到整個(gè)葉片，形成黃綠相間的斑駁，繼而形成花葉。 病葉有時(shí)形成泡斑，葉片邊緣多向背面卷曲，皺縮扭曲畸形。早期受害植株矮化，生長極為 緩慢，重病植株花器變形、果實(shí)變形，種子萌發(fā)率降低，造成煙草產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降。
[0006] 鑒于煙草普通花葉病毒病對(duì)農(nóng)業(yè)造成的巨大損失，科研人員一直致力于煙草普通 花葉病毒病的防治工作。逐步摸索出以預(yù)防為主，防治結(jié)合的措施。
[0007] 選育和利用抗病品種。這也是最根本，最經(jīng)濟(jì)有效的措施。對(duì)TMV抗性較好的品 種有吉煙5號(hào)、中煙90、遼煙8號(hào)、遼煙10號(hào)、CV91等，同時(shí)，還從國外引進(jìn)一批具有較好抗 性的煙草品種，如柯克86和白肋21等。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，科研人員還利用轉(zhuǎn) 基因的方法，獲得抗病毒植株。
[0008] 農(nóng)業(yè)防治措施。生產(chǎn)實(shí)踐中，通過選用無毒種子、培育無毒壯苗、加強(qiáng)苗床及田間 管理、合理輪作等一系列農(nóng)業(yè)措施，消除TMV的初侵染來源，阻斷病毒傳播途徑，從而較少 煙草普通花葉病毒病的發(fā)生。
[0009] 藥劑防治，早期病毒病的防治主要依賴于化學(xué)藥劑。化學(xué)農(nóng)藥高毒、高殘留和易產(chǎn) 生抗藥性的特點(diǎn)，使其在使用方便、見效快的同時(shí)也存在著污染環(huán)境、威脅人類健康等諸多 不利因素。近年來，生物農(nóng)藥因其對(duì)人畜安全、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)而逐步被人 們所接受。生物農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，可以有效降低化學(xué)農(nóng)藥的使用，提高農(nóng)民收入，保障食品 安全。國際上，生物農(nóng)藥市場增長迅速，銷售額占全部農(nóng)藥的20%左右（2000年）。我國生 物農(nóng)藥行業(yè)也隨之快速發(fā)展，未來生物農(nóng)藥所占農(nóng)藥份額預(yù)計(jì)可增加到30%左右。生物農(nóng) 藥主要包括微生物源農(nóng)藥（細(xì)菌、真菌、病毒等）、植物源農(nóng)藥、生物化學(xué)農(nóng)藥等。目前微生 物源生物農(nóng)藥應(yīng)用普遍，涵蓋了殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑等多個(gè)領(lǐng)域。蘇 云金芽孢桿菌（BT)、白僵菌、綠僵菌、寧南霉素、啼肽霉素、枯草芽孢桿菌等一大批微生物源 生物農(nóng)藥已經(jīng)成功進(jìn)入市場，并為人們所熟知與認(rèn)可。
[0010] 植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種 組織和器官內(nèi)部、不引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病癥的微生物。植物內(nèi)生菌包括真菌、細(xì)菌和放線 菌。研究表明，植物內(nèi)生菌通過分泌生長素和增加宿主植物對(duì)于氮、磷等主要營養(yǎng)元素的吸 收來促進(jìn)植物生長；通過促進(jìn)根的發(fā)育、調(diào)節(jié)氣孔的閉合和調(diào)節(jié)滲透壓等來提高植物對(duì)干 旱及其他非生物脅迫的抵抗能力；通過分泌抗生素類、水解酶、生物堿等物質(zhì)、與病原菌競 爭營養(yǎng)物質(zhì)和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR)來實(shí)現(xiàn)對(duì)病蟲害的生物防控作用。因此，植物 內(nèi)生菌作為一類重要的微生物也成為近年來的研究熱點(diǎn)，被逐漸開發(fā)成天然醫(yī)用和農(nóng)用藥 物。
[0011] 植物內(nèi)生菌廣泛存在與植物體內(nèi)，分布廣泛、種類繁多，作為新的篩選來源具有極 大的開發(fā)潛力。植物內(nèi)生菌易于在植株中定殖，寄主適應(yīng)性更好，能更好地為實(shí)際生產(chǎn)中生 物防治手段提供技術(shù)支持。
[0012] 國內(nèi)對(duì)于煙草普通花葉病毒病生物防治的報(bào)道，生防菌的篩選來源多來自于植物 根際土壤、根圍及其它微生物區(qū)系中，來源于植物內(nèi)部的生防菌對(duì)于TMV的抑制作用報(bào)道 較少，但尚未見煙草內(nèi)生菌對(duì)于TMV的抑制作用報(bào)道。
[0013] 因此本申請(qǐng)從煙草內(nèi)生菌方向進(jìn)行探索，篩選了防治效果好的TMV拮抗菌株，擴(kuò) 充抗TMV植物內(nèi)生菌資源，為深入揭示煙草內(nèi)生菌抗TMV機(jī)制和進(jìn)一步研發(fā)微生物源抗病 毒制劑提供保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足，從煙草內(nèi)部分離、篩選出一種TMV拮抗 菌株，制備該菌株的發(fā)酵液，同時(shí)提取該菌株胞內(nèi)對(duì)TMV有防治作用的蛋白粗提液。
[0015] 本發(fā)明所述菌株鑒定為奠產(chǎn)堿菌（Alcaligenesfaecalis)。菌株代號(hào)為L1，該菌 株于2014年10月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 9758。
[0016] 本發(fā)明菌株L1具有如下性質(zhì)：
[0017] 通過觀察本發(fā)明菌株L1于28°C在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24h后的菌落形態(tài)顯示， 該菌菌落為乳白色不透明，邊緣整齊，表面光滑，無水溶性色素，參見圖1，菌株L1菌體多以 單個(gè)個(gè)體存在，菌體呈短桿狀或球桿狀，有莢膜，周生鞭毛，參見圖2,革蘭氏染色為紅色。
[0018] 生理生化特征見表1:
[0019] 表1本發(fā)明菌株L1生化鑒定結(jié)果
[0020]
[0022] 注：+陽性結(jié)果；-陰性結(jié)果。
[0023] 利用非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管對(duì)L1進(jìn)行生化鑒定。將鑒定結(jié)果在非發(fā)酵細(xì)菌生化 鑒定編碼手冊(cè)上進(jìn)行比對(duì)，菌株L1與糞產(chǎn)堿菌的相似性為0. 4410。
[0024] 通過分析本菌株遺傳特征的保守序列16SrDNA，在GenBank(www.ncbi.nlm.nlh. gov)網(wǎng)站上應(yīng)用BLAST軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌株LI測得的序列與糞產(chǎn)堿菌16SrDNA部分 序列同源性達(dá)99%，同時(shí)應(yīng)用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3)，發(fā)現(xiàn)菌株L1與糞產(chǎn)堿 菌（Alcaligenesfaecalis)遺傳距離最近。綜合生理生化鑒定及ITS序列分子鑒定結(jié)果， 確定本發(fā)明菌株L1為奠產(chǎn)喊菌（Alcaligenesfaecalis)，命名為L1。
[0025] 該菌株L1發(fā)酵液的制備，方法如下：
[0026] 1)挑取培養(yǎng)基平板上生長良好的菌株L1的單一菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 活化，于 28°C，180rpm，培養(yǎng) 24h;
[0027] 2)將活化后的菌液以2%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵 液。培養(yǎng)條件為：溫度28°C，pH7. 0,時(shí)間22h，轉(zhuǎn)速180rpm;
[0028] 該菌株L1胞內(nèi)對(duì)TMV有防治作用的蛋白粗提液制備，方法如下：
[0029]1)上述發(fā)酵液經(jīng)8000rpm離心lOmin，沉淀加0. 1MPBS洗滌3次，然后于4°C， 8000rpm離心lOmin;
[0030] 2)沉淀溶解在0. 1MPBS中，經(jīng)超聲破碎儀破碎后，4°C，llOOOrpm離心lOmin。上 清液過0. 22ym濾膜，緩慢加入4倍于上清液體積的飽和硫酸銨，4°C靜置過夜。；
[0031] 3)液體在4°C下，8000rpm離心20min，沉淀用少量體積的PBS-疊氮化鈉溶液溶 解。然后置于分子量為8000Da的透析袋中，透析48h，每隔4h更換透析緩沖液一次（去離 子水），以徹底除去硫酸氨，最終獲得胞內(nèi)蛋白粗提液。
[0032] 本發(fā)明的有益效果；
[0033] 本發(fā)明獲得的拮抗煙草普通花葉病毒病的生防內(nèi)生菌糞產(chǎn)堿菌菌株L1，可應(yīng)用于 對(duì)煙草普通花葉病毒病的防治，采用接種枯斑寄主三生-NN煙的生物學(xué)測定表明，發(fā)酵液 對(duì)TMV的抑制率為82. 81%;涂抹發(fā)酵液12h后的預(yù)防作用為34. 58%;接種TMV12h后涂 抹發(fā)酵液的治療作用為21. 81 %。菌株L1的胞內(nèi)蛋白粗提液對(duì)TMV的抑制率為87. 84% ; 涂抹胞內(nèi)蛋白粗提液12h后的預(yù)防作用為66. 42%;接種TMV12h后涂抹胞內(nèi)蛋白粗提液的 治療作用為29.26%。電鏡下觀察到發(fā)酵液在體外對(duì)TMV粒體具一定斷裂和分散作用。菌 株L1的發(fā)酵液及胞內(nèi)蛋白粗提液對(duì)TMV具有體外鈍化、抑制侵染和增殖的作用，具有實(shí)際 的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0034] 通過閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明 的限制。在附圖中：
[0035]圖1為本發(fā)明的菌株L1在LB固體平板培養(yǎng)基上的劃線圖；
[0036] 圖2為本發(fā)明的菌株L1透射電鏡下的菌體形態(tài)；
[0037]圖3為本發(fā)明的菌株L1的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0038] 圖4為本發(fā)明菌株L1對(duì)TMV的拮抗活性效果圖；
[0039] 其中，左半葉為空白對(duì)照，右半葉為處理；
[0040] 圖5為發(fā)酵液處理后TMV的粒體形態(tài)圖；
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