[0143] 20XSSC濃縮緩沖液：
[0144]1000 mL水中，加入氯化鈉175. 3g，檸檬酸銨88. 2g。
[0145] HER-2/CEP17探針：
[0146] 使用甲酰胺、硫酸葡聚糖鈉鹽將HER-2及CEP17,配制為探針工作液。
[0147]BSA粉末：
[0148] 外購(gòu)分裝。
[0149]CD45-AF594 熒光抗體：
[0150] 將⑶45抗體與Alexa Flour 594熒光素避光孵育lh，熒光素即可與⑶45抗體連 接。
[0151]DAPI染色液：
[0152] 使用防淬滅劑Mountingmedium將lmg/mL的DAPI原液按照1:1000進(jìn)行稀釋，配 制為DAPI染色工作液。
[0153] 試劑盒二僅包含5)-12)部分，制備方法相同。
[0154] 實(shí)施例3
[0155] 用本發(fā)明的試劑盒一對(duì)其他體液樣本進(jìn)行檢測(cè)
[0156] 說明：本試劑盒不僅適用于血液，也適用于其他體液中稀有細(xì)胞的檢測(cè)，例如胸 水、腹水、盥洗液、羊水等，但不限于這幾種體液。
[0157] 使用本試劑盒對(duì)6例胃癌腹水進(jìn)行檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)CEP17擴(kuò)增型陽(yáng)性細(xì)胞，中位值 9. 5 (范圍4-15)。其中2例發(fā)現(xiàn)HER-2擴(kuò)增型陽(yáng)性細(xì)胞，數(shù)量分別為：2, 5。
[0158] 實(shí)施例4
[0159] 使用試劑盒二對(duì)其他方法獲取到的CTC進(jìn)行檢測(cè)
[0160] 說明：試劑盒二中組份，即HER-2/CEP17探針、⑶45-AF594熒光抗體、DAPI染色液 等，也適用于其他方法獲取到的CTC，例如過濾法、ChIP法等等，但不限于這兩種方法。
[0161] 使用膜過濾法對(duì)12例乳腺癌外周血標(biāo)本進(jìn)行處理，將直徑為Sum的 Ispore?MembraneFilters配合SWINNEX濾器配合使用。具體方法為，首先將5mL血液標(biāo) 本與IOmLPBS混勻，加入至過濾器中，通過重力作用自然沉降，CTC因體積較大，留在膜表 面，將濾膜轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)載玻片上。干燥后，按照試劑盒二的操作方法對(duì)CTC進(jìn)行染色處理， 方法如下：將干燥后的標(biāo)本經(jīng)過CF2固定工作液8分鐘；吸棄液體，放入已預(yù)熱的2XSSC 染缸10分鐘；依次放入75%、85%、無水乙醇中脫水2分鐘；加入10此1^-2/^?17探針， 蓋上蓋玻片，封片并放入雜交儀或其他控溫裝置，76°C5分鐘，37°C4小時(shí)；取出標(biāo)本，揭去 蓋玻片，放入已預(yù)熱的甲酰胺工作液中15分鐘；置于2XSSC中洗滌5分鐘；加入配制好的 CD45-AF594熒光抗體（20uL抗體+180uL2%BSA)，每玻片200uL，避光反應(yīng)1小時(shí)；吸棄多 余液體，0. 2%BSA清洗1-3次，加入DAPI復(fù)染劑10uL，封片，并在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果 統(tǒng)計(jì)，9例表現(xiàn)出CEP17擴(kuò)增型CTC陽(yáng)性，2例HER-2擴(kuò)增型陽(yáng)性。
[0162] 實(shí)施例5
[0163] 本試劑盒一適用于血液中其他稀有細(xì)胞的檢測(cè)
[0164] 說明：有些患者血液中含有CEC(即循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞），本試劑盒同樣可以檢測(cè)。
[0165] 使用本試劑盒對(duì)5例腎癌患者進(jìn)行了CEC的檢測(cè)，其中1例檢測(cè)出HER-2擴(kuò)增型 CEC2 個(gè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于稀有細(xì)胞檢測(cè)HER-2/CEP17基因狀態(tài)的方法，其特征在于，所述方法包括 以下步驟： 步驟1，從患者獲得血液樣本或其他含有稀有細(xì)胞的體液樣本，樣本中包含CTC或其他 稀有細(xì)胞與白細(xì)胞的混合細(xì)胞群； 步驟2,用緩沖液稀釋樣本，離心去除血漿，并回收CTC或其他稀有細(xì)胞； 步驟3,用紅細(xì)胞裂解液裂解，離心去除紅細(xì)胞并回收CTC或其他稀有細(xì)胞； 步驟4,用包被有抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗體的磁微粒同步驟3所得的回收細(xì)胞混勻孵 育，以使磁微粒同標(biāo)的白細(xì)胞充分結(jié)合并形成磁微粒-白細(xì)胞混合體； 步驟5,離心將磁微粒-白細(xì)胞混合體與其他細(xì)胞分離，得到含有CTC或其他稀有細(xì)胞 及少量白細(xì)胞的混合細(xì)胞群； 步驟6,使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)與熒光原位雜交的相結(jié)合的方法，測(cè)定HER-2/CEP17的 狀態(tài)，同時(shí)進(jìn)行CTC或其他稀有細(xì)胞的鑒別。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2所述緩沖液為與血液密度相近、包 含BSA及PBS、PH7-8的緩沖液，其中，步驟3所述紅細(xì)胞裂解液為任意一種紅細(xì)胞裂解液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4所述包被有抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗 體的磁微粒為一種包被抗白細(xì)胞共同抗原抗體的鏈親和素磁珠，能夠牢固地結(jié)合白細(xì)胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5所述離心介質(zhì)為一種密度介于 1. 070-1. 080之間的密度梯度離心液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6所述使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)與熒光 原位雜交的方法，測(cè)定HER-2/CEP17,對(duì)CTC或其他稀有細(xì)胞進(jìn)行鑒別，方法如下： (1) HER-2擴(kuò)增型CTC :將標(biāo)本置于熒光顯微鏡相應(yīng)通道下觀察，若發(fā)現(xiàn)多個(gè)HER-2信號(hào) 點(diǎn)分布（彡3個(gè)），且數(shù)目大于CEP17的信號(hào)點(diǎn)數(shù)，并且無⑶45抗原表達(dá)，則計(jì)為一個(gè)CTC 陽(yáng)性細(xì)胞，且直接視該細(xì)胞為ffiR-2陽(yáng)性細(xì)胞； (2) 染色體擴(kuò)增型CTC :計(jì)數(shù)單個(gè)有核細(xì)胞CEP17信號(hào)數(shù)目，若大于等于3個(gè)信號(hào)點(diǎn)且 無⑶45抗原表達(dá)，則計(jì)為一個(gè)CTC陽(yáng)性細(xì)胞； (3) HER-2/CEP17-CTC總數(shù)目：記錄所有HER-2擴(kuò)增型及染色體擴(kuò)增型CTC數(shù)目，總和 視為 HER-2/CEP17-CTC 總數(shù)目； (4) HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)記錄：在所有標(biāo)本區(qū)域中若有明顯且典型HER-2擴(kuò)增，則記為 HER-2擴(kuò)增；若無，則將所有CTC細(xì)胞內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞核中HER-2信號(hào)數(shù)量、平均每個(gè)細(xì)胞 核中CEP17信號(hào)數(shù)量、平均每個(gè)細(xì)胞核中HER-2和CEP17信號(hào)數(shù)量比值的結(jié)果。6. -種用于權(quán)利要求1方法的試劑盒，其特征在于，包括如下成分： CSl濃縮緩沖液（IOX) CS2濃縮儲(chǔ)存液（IOX) CS3分離介質(zhì) 磁微?；鞈乙?CFl固定液 10XCF2固定液 DAPI染色液 HER-2/CEP17 探針 CD45-AF594熒光抗體 甲酰胺工作液 20 X SSC濃縮緩沖液 BSA07. 權(quán)利要求6所述試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟如下： (1) 將0. l-5mL血液標(biāo)本加入至50mL離心管中，加入稀釋好的CSl工作液至45mL， 650 X g離心5分鐘，吸棄上清并剩余約12mL液體； (2) 輕搖混勻，加入稀釋好的CS2裂解工作液至45mL，混勻8-10分鐘，650 X g離心5分 鐘，吸棄上清液體； (3) 加入CSl工作液適量并輕搖混勻，再次加入一定量CSl工作液，加入清洗過的磁微 ?；鞈乙?00uL，水平搖勻（120rpm) 20分鐘； (4) 吸取全部混勻后液體，疊加至CS3分離介質(zhì)上，300 X g離心5分鐘； (5) 吸取除磁微粒沉淀以外的上兩層液體至15mL離心管中，加入CSl工作液至15mL， 950 X g離心5分鐘，吸棄上清； (6) 加入ImL CSl工作液，吹打混勻并加入至新2mL離心管中，磁力分選2分鐘。轉(zhuǎn)移 上清至I. 5mL離心管中，放置在15mL離心管上，3400rpm離心3分鐘； (7) 吸棄上清，加入CFl固定液，吹打混勻并涂片，自然晾干； (8) 加入CF2固定工作液，計(jì)時(shí)8-10分鐘； (9) 吸棄液體，放入已預(yù)熱的2XSSC染缸10分鐘； (10) 依次放入75%、85%、無水乙醇中2-5分鐘； (11) 加入IOuL HER-2/CEP17探針，蓋上蓋玻片，封片并放入雜交儀或其他控溫裝置， 76°C 5 分鐘，37°C 4-20 小時(shí)； (12) 取出標(biāo)本，撕下封片物質(zhì)，放入已預(yù)熱的甲酰胺工作液，計(jì)時(shí)15分鐘； (13) 置于2 X SSC中5-10分鐘； (14) 取出，加入配制好的CD45-AF594熒光抗體（20uL抗體+180uL 2% BSA)，每玻片 200uL，避光反應(yīng)1-5小時(shí)； (15) 吸棄多余液體，0. 2% BSA清洗1-3次，加入DAPI復(fù)染劑10uL，封片。8. -種用于權(quán)利要求1方法的試劑盒，其特征在于，包括如下成分： CFl固定液 10XCF2固定液 DAPI染色液 HER-2/CEP17 探針 CD45-AF594熒光抗體 甲酰胺工作液 20 X SSC濃縮緩沖液 BSA09. 權(quán)利要求8所述試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟如下： (1)將本方法步驟（7)或其他方法獲得的細(xì)胞懸液，涂于載玻片或膜片上，并自然晾 干，加CF2固定工作液，計(jì)時(shí)8-10分鐘； ⑵吸棄液體，放入已預(yù)熱的2XSSC染缸10分鐘； (3) 依次放入75%、85%、無水乙醇中2-5分鐘； (4) 加入IOuL HER-2/CEP17探針，蓋上蓋玻片，封片并放入雜交儀或其他控溫裝置， 76°C 5 分鐘，37°C 4-20 小時(shí)； (5) 取出標(biāo)本，撕下封片物質(zhì)，放入已預(yù)熱的甲酰胺工作液，計(jì)時(shí)15分鐘； (6) 置于2 X SSC中5-10分鐘； (7) 取出，加入配制好的⑶45-AF594熒光抗體（20uL抗體+180uL 2% BSA)，每玻片 200uL，避光反應(yīng)1-5小時(shí)； (8) 吸棄多余液體，0. 2 % BSA清洗1-3次，加入DAPI復(fù)染劑10uL，封片。10.權(quán)利要求6或8任意一項(xiàng)試劑盒在測(cè)定稀有細(xì)胞的同時(shí)，檢測(cè)HER-2/CEP17基因狀 態(tài)的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于稀有細(xì)胞檢測(cè)HER-2/CEP17基因狀態(tài)的方法及試劑盒，所述方法包括以下步驟：步驟1，獲得血液樣本或體液樣本，樣本中包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞或其他稀有細(xì)胞與白細(xì)胞的混合細(xì)胞群；步驟2，用緩沖液稀釋樣本，去除血漿，并回收CTC或其他稀有細(xì)胞；步驟3，用紅細(xì)胞裂解液裂解，去除紅細(xì)胞，并回收CTC或其他稀有細(xì)胞；步驟4，用包被有抗人白細(xì)胞相關(guān)抗原抗體的磁微粒同回收細(xì)胞混勻孵育，結(jié)合并形成磁微粒-白細(xì)胞混合體；步驟5，離心將磁微粒-白細(xì)胞混合體與其他細(xì)胞分離，得到含有CTC或其他稀有細(xì)胞及少量白細(xì)胞的混合細(xì)胞群；步驟6，使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)與熒光原位雜交的相結(jié)合的方法，測(cè)定HER-2/CEP17的狀態(tài)，同時(shí)進(jìn)行CTC或其他稀有細(xì)胞的鑒別。
【IPC分類】G01N33/58, C12Q1/68, G01N33/573
【公開號(hào)】CN105087778
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510441612
【發(fā)明人】詹廳, 楊瑛杰, 馬妤婕
【申請(qǐng)人】北京萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年7月24日