一種基于稀有細胞檢測her-2/cep17基因狀態(tài)的方法及相關(guān)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學診斷學，特別涉及腫瘤細胞的檢測。更具體地講，本發(fā)明涉及檢測 癌癥和評估患者的治療方案的診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 循環(huán)腫瘤細胞（CirculatingTumorCell,CTC)指進入到血液循環(huán)中的腫瘤細胞， 其可由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落入血，亦可能在形成實體瘤病灶之前進入血液中。腫瘤細胞侵 入循環(huán)系統(tǒng)，大部分由于機體的免疫識別、機械殺傷及自身凋亡在短期內(nèi)死亡，只有極少數(shù) 存活下來，并在遠端或原發(fā)組織及器官種植，進一步發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，是導致腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā) 的最直接因素。
[0003]CTC作為一種可以代表原發(fā)腫瘤的"液體活檢"樣本，外周血標本易獲取、創(chuàng)傷性 小、可反復采集，是臨床檢測更為理想的標本來源，可對腫瘤治療進行實時全面監(jiān)測。可有 效實現(xiàn)腫瘤復發(fā)預(yù)警，療效及時評價以及腫瘤個體化治療用藥指導，目前CTC檢測已廣泛 運用于臨床腫瘤患者的療效實時評價、病情實時監(jiān)測、耐藥析因、預(yù)后判斷中。
[0004]焚光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是一種細胞遺傳學 技術(shù)，可以用來對核酸進行檢測和定位。目前基于脫落稀有細胞的FISH技術(shù)一般為定性檢 測，很難做到精準定量且保證其效果。究其根本原位在于目前適用于組織標本的FISH檢測 方法及普通的脫落細胞學FISH檢測方法，當數(shù)量級在0-100間的細胞涂片后，無法在著色 效果和有效保持細胞方面取得較好的平衡并保持較高的穩(wěn)定性，更難以形成有效穩(wěn)定定量 檢測的成型產(chǎn)品。目前雖有相應(yīng)專利闡述一種有效方法（US6, 524, 798)，但需極其高昂成 本的專用檢測設(shè)備，無法在常規(guī)實驗室完成這基于及少量稀有細胞、甚至是單細胞層面的 FISH檢測工作。
[0005] 此前已描述了來自生物樣品的腫瘤細胞、稀少細胞或其他生物實體的鑒定方法 (如中國專利【申請?zhí)枴?00810097889. 4、201310057307. 0)。此兩步法要求有效富集以確保 在分析之前獲取靶細胞，同時去除大量碎片和其他干擾物質(zhì)，使得可通過成像技術(shù)進行細 胞檢驗。此方法以獨特的陰性富集策略將免疫磁微粒與多密度離心方式、熒光原位雜交和 免疫熒光細胞化學分析組合起來，精確定量地檢測幾乎所有實體腫瘤類型中脫落至含血 液、胸/腹腔積液、尿液、腦脊液等多種生物體液標本中的稀有細胞（含CTC)。此組合方法 用于富集和計數(shù)血樣中的染色體擴增型腫瘤細胞，因此提供了一種量度癌癥的工具。
[0006] 原癌基因人類表皮生長因子受體2(HER-2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色 體17ql2_21. 32上，編碼相對分子質(zhì)量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。 目前基于HER-2基因的檢測，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的預(yù)后分析，尤其是基于 HER-2靶點的曲妥珠單抗（商品名：Here印tin)藥物的臨床應(yīng)用方面。
[0007]《乳腺癌HER-2檢測指南》中指出乳腺癌HER-2檢測方法及報告推薦用兩種方法檢 測乳腺癌HER-2,即檢測蛋白的免疫組化法（IHC)和檢測基因的熒光原位雜交（FISH)法，該 指南建議，ffiR-2檢測FISH報告主要包括：所計數(shù)的浸潤癌細胞數(shù)量、平均每個細胞核中HER-2信號數(shù)量、平均每個細胞核中CEP17信號數(shù)量、平均每個細胞核中HER-2和CEP17信 號數(shù)量的比值。
[0008] 但是臨床檢測時，會由于例如已手術(shù)切除、患者主觀意愿不脅從等諸多無法有效 獲得腫瘤組織的情況，而存在以下局限性：
[0009] 1、作為有創(chuàng)性且受限于病灶位置的組織學檢測，存在標本取材不易或無法取材等 局限性，且術(shù)后不能反復取材，導致組織取材無法提供實時性的監(jiān)測信息。
[0010] 2、且受治療的影響等，腫瘤細胞的分子信息有可能發(fā)生動態(tài)改變。如：有研究報 道，接受新輔助化療的乳腺癌患者，在化療前接受活檢，并將結(jié)果與術(shù)后病理進行對照，發(fā) 現(xiàn)存在治療前后ffiR-2表達不一致的情況。
[0011] 3、腫瘤組織異質(zhì)性的存在以及單點活檢造成的只是局部信息反映的現(xiàn)狀，使得傳 統(tǒng)組織學檢測缺乏全面整體性的評價，如原發(fā)灶、多發(fā)轉(zhuǎn)移灶信息的綜合評價等。
[0012] 本發(fā)明在于提供了一種檢測CTC或其他稀有細胞的同時對HER-2/CEP17的數(shù)量及 比值進行檢測的方法。以獲得更加全面的信息。本發(fā)明在分離獲取血液中CTC(或其他稀 有細胞）的基礎(chǔ)上，進行單細胞分子分析，檢測ffiR-2表達情況，以此來從單細胞水平上，即 時地發(fā)現(xiàn)HER-2的分子信息，以便對患者的狀態(tài)進行實時觀察。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供一種檢測CTC或其他稀有細胞的同時對HER-2/CEP17的數(shù)量及比值進 行檢測的方法。直接幫助臨床醫(yī)師了解腫瘤患者實時的基因狀態(tài)，以輔助預(yù)測生存情況并 擬定下一步治療方案。本發(fā)明的方法包括以下全部及部分步驟：
[0014] 步驟1，從患者獲得血液樣本或其他含有稀有細胞的體液樣本，樣本中包含CTC或 其他稀有細胞與白細胞的混合細胞群；
[0015] 步驟2,用緩沖液稀釋樣本，離心去除血漿，并回收CTC或其他稀有細胞；
[0016] 步驟3,用紅細胞裂解液裂解，離心去除紅細胞并回收CTC或其他稀有細胞；
[0017] 步驟4,用包被有抗人白細胞相關(guān)抗原抗體的磁微粒同步驟3所得的回收細胞混 勻孵育，以使磁微粒同標的白細胞充分結(jié)合并形成磁微粒-白細胞混合體；
[0018] 步驟5,離心將磁微粒-白細胞混合體與其他細胞分離，得到含有CTC或其他稀有 細胞及少量白細胞的混合細胞群；
[0019] 步驟6,使用免疫熒光細胞化學與熒光原位雜交的相結(jié)合的方法，測定HER-2/ CEP17的狀態(tài)，同時進行CTC或其他稀有細胞的鑒別。
[0020] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟2所述緩沖液為一種與血液密度相近的緩沖液，含 有BSA、PBS等物質(zhì)，pH7-8之間，能夠保證去除血漿的同時，保護各種有核細胞。
[0021] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟3所述紅細胞裂解液為一種紅細胞裂解液，利用等 滲不等張的原理，裂解紅細胞的同時，不會損傷其他有核細胞。
[0022] 如以下配方的裂解液：
[0023] NH4C1 82. 9g
[0024] KHC0310g
[0025] EDTAO. 37g
[0026] 加H20至1000ml(高壓滅菌，4°C保存）
[0027]或
[0028] 紅細胞裂解液（Tris-MMCl):稱取3. 735g氯化銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris)I. 3g 加水溶解并稀釋至500ml。0. 22ym濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0029] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟4所述包被有抗人白細胞相關(guān)抗原抗體的磁微粒 為一種包被抗白細胞共同抗原抗體的鏈親和素磁珠。能夠最大量地、牢固地結(jié)合白細胞，利 于后續(xù)的分選處理。
[0030] 本發(fā)明所述的方法，其中步驟5所述離心介質(zhì)為一種密度介于1. 070-1. 080之間 的密度梯度離心液，其中以1. 072最優(yōu)，可以在去除結(jié)合磁珠的白細胞的同時，保存其他單 個有核細胞不丟失。
[0031] 本發(fā)明所述的方法，其中，步驟6所述使用免疫熒光細胞化學與熒光原位雜交的 方法，對CTC或其他稀有細胞進行CTC鑒別，同時測定HER-2/CEP17,方法如下：
[0032] (l)HER-2擴增型CTC:將標本置于熒光顯微鏡相應(yīng)通道下觀察，若發(fā)現(xiàn)多個HER-2 信號點分布（彡3個），且數(shù)目大于CEP17的信號點數(shù)，并且無⑶45抗原表達，則計為一個 CTC陽性細胞，且直接視該細胞為HER-2陽性細胞；
[0033] (2)染色體擴增型CTC:計數(shù)單個有核細胞CEP17信號數(shù)目，若大于等于3個信號 點且無⑶45抗原表達，則計為一個CTC陽性細胞；
[0034] (3)HER-2/CEP17-CTC總數(shù)目：記錄所有HER-2擴增型及染色體擴增型CTC數(shù)目， 總和視為HER-2/CEP17-CTC總數(shù)目；
[0035] (4)HER-2基因擴增狀態(tài)記錄：在所有標本區(qū)域中若有明顯且典型HER-2擴增，則 記為HER-2擴增；若無，則將所有CTC細胞內(nèi)平均每個細胞核中HER-2信號數(shù)量、平均每個 細胞核中CEP17信號數(shù)量、平均每個細胞核中HER-2和CEP17信號比值的結(jié)果。
[0036] -種用于上述方法的試劑盒一，包括如下成分：
[0037]
[0038]
[0039] 其中，IOX、20X表示濃度，即該溶液為10倍/20倍的濃度。
[0040] 本發(fā)明所述的試劑盒制備方法如下：
[0041] 試劑盒一包含下述富集及鑒別兩部分的試劑。
[0042] 富集部分：
[0043] CSl濃縮緩沖液（IOX):
[0044] 每1000 mL水中，含有 60gBSA，5 包PBS粉末（2L/ 包），IOOmL0? 5M的EDTA，0? 8mL Proclin300。
[0045] CS2濃縮儲存液（IOX):
[0046]每1000 mL水中，稱取 82. 9gNH4Cl、10gKHC03、0. 37gEDTA，水以及 0? 8mL Proclin300,進行充分的攪拌溶解，定容，配制為IOX濃縮液。
[0047]CS3分離介質(zhì)：
[0048] 將密度為1. 077的梯度離心液稀釋，稀釋過程中測試密度，使其密度在 1. 070-1. 075 之間。
[0049] 磁微粒混懸液：
[0050] 將⑶45抗體濃度調(diào)整為lmg/mL，與鏈親和素免疫磁珠按照IOOuL:ImL的比例進行 孵育lh，即配制為磁微粒混懸液。
[0051] 鑒別部分：
[0052] CFl固定液：
[0053] 混合PEG和無水乙醇，使PEG終濃度為1 %，無水乙醇終濃度為50 %。
[0054] 10XCF2 固定液：
[0055] 以PBS為溶劑，溶解PFA粉末，配制為5 %的PFA濃縮液。
[0056] 甲酰胺工作液：
[0057] 將甲酰胺原液稀釋為50%的工作液。
[0058] 20XSSC濃縮緩沖液：
[0059]1000 mL水中，加入氯化鈉175. 3g，檸檬酸銨88. 2g。
[0060]HER-