對霍亂弧菌o18，o19，o23和o12特異的核苷酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對霍亂弧菌018, 019, 023和012血清型特異的核苷酸，尤其涉及對霍 亂弧菌018, 019, 012和018血清型0抗原基因簇中單個基因特異的核苷酸及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 霍亂弧菌（Vibriocholerae)屬于弧菌屬，是霍亂的病原菌，霍亂是一種烈性腸道 傳染病，是流傳時間長、影響范圍廣的一種食源性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和由 此引起的體液丟失、脫水、周身循環(huán)衰竭、電解質(zhì)紊亂、低鉀綜合癥、腹部痙攣甚至死亡，被 世界衛(wèi)生組織確定為必須國際檢疫的傳染病之一，《中華人民共和國傳染病防治法》將其列 為應(yīng)實施"強制管理"的甲類傳染病。
[0003] 細菌分型與鑒定方法主要有傳統(tǒng)的表型方法、血清學方法以及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學的發(fā)展，傳統(tǒng)的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型這 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，不 同的〇抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學技術(shù)的血清 鑒定方法成為發(fā)展方向。
[0004] 霍亂弧菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為霍亂弧菌菌種與株型鑒定的重 要依據(jù)，不少新菌也因此產(chǎn)生。對弧菌而言，生化反應(yīng)主要是各種酶譜的表現(xiàn)，屬于外部形 態(tài)的內(nèi)容，核酸的相似性才是弧菌種的界定最根本、最直接的特征。因此，霍亂弧菌的分型 與鑒定最有效、最直接的方式應(yīng)該從核酸的研究觸發(fā)，通過比較核酸(包括基因組與核酸片 段）的相似性確定霍亂弧菌的歸屬。
[0005] 近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)（ITS)序列分析、隨機擴增長度多態(tài)性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態(tài)性（RFLP)分析等。分子生物學方法不僅可用于霍亂弧菌的快速血清分型篩查，穩(wěn)定的 鑒定結(jié)果可以彌補表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈式 反應(yīng)（PCR)的分子檢測技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、純培養(yǎng)等過程，而且具有快速、靈 敏、特異性強等優(yōu)點。
[0006] 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（Polymerasechainreaction,簡稱PCR技術(shù)）作為微生物 檢測技術(shù)目前正在得到認同和推廣，該技術(shù)相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強、靈敏度高等優(yōu)點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備 細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需1個半小時。這對檢驗檢疫部 門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0007] 不論從國內(nèi)和國際的角度來看，快速、準確地鑒定出血清類型，為霍亂弧菌的防控 提供有效技術(shù)支持是十分重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供了一種對霍亂弧菌0抗原特異的核苷酸，其特征在于所述 的核苷酸具有： 1)SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一種； 2)與SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸互補的核苷酸中的至少一種；所述的SEQIDNO: 1-8 如下：
本發(fā)明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一種。所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mMdNTP30y1 ; 10X酶特異性反應(yīng)緩沖液50yI;5U/y1耐熱DNA聚合酶5y1 ;引物混合 物10y1;陽性對照品10y1;陰性對照品10yI;ddH2〇 5ml。
[0009] 其中所述的PCR引物優(yōu)選為所述如SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一種。
[0010] 本發(fā)明進一步公開了一種對霍亂弧菌〇抗原特異的SEQIDNO: 1-8核苷酸在制備 用于檢測霍亂弧菌0抗原PCR試劑盒、基因芯片或微陣列方面的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所述霍亂弧菌可以取樣于自來水、霍亂水、海水、土壤的培養(yǎng)物的粗提液， 或是霍亂弧菌的純培養(yǎng)物的粗提液等。
[0012] 收集霍亂弧菌提取基因組是米用常規(guī)方法制備獲得。
[0013] 針對霍亂弧菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理一擴增一電泳檢測結(jié) 果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后的樣 本加入擴增管啟動擴增反應(yīng)即可，簡單快速的完成檢測工作。
[0014] 本發(fā)明還提供一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探 針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQIDNO: 1-8所 示的核苷酸。
[0015] 本發(fā)明還提供一種微列陣，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQ IDNO: 1-8所示的核苷酸。檢測變形桿菌的基因芯片方面、檢測變形桿菌微陣列方面的應(yīng) 用。所述的變形桿菌指的是檢測霍亂弧菌指的是檢測由于污染水源和未煮熟的食物中毒、 腹瀉、腸道傳染病、醫(yī)院內(nèi)感染等多種混合型感染的細菌。
[0016] 本發(fā)明公開的一種對霍亂弧菌0抗原特異的核苷酸與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有 如下優(yōu)點： (1)實用性強：本發(fā)明建立的一種PCR反應(yīng)體系，可檢測霍亂弧菌，提供血清分型檢測 所用到的特異引物，利用該PCR方法可以對臨床標本進行檢測。
[0017] (2)準確性高：本發(fā)明通過對霍亂弧菌的各血清型特異的基因的PCR反應(yīng)，每個樣 品得到一條目的條帶，將得到目的片段與已知長度相比較，就可以得到霍亂弧菌所屬的血 清型。
[0018] (3)檢測成本相對較低：可以推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、尚品監(jiān)測檢驗 檢疫等領(lǐng)域，并為其他不同致病菌檢測組合提供技術(shù)模式。
[0019] 以上所述，僅是本發(fā)明的操作和實施方法而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限 制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍 屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
[0020]
【附圖說明】： 圖1表示本發(fā)明018血清型特異引物檢測霍亂弧菌其他血清型標準菌株電泳結(jié)果圖，rzz基因Pl和P2引物的篩選，目的條帶為198bp，其余的血清型沒有任何條帶具體菌株信 息見表2 ; 圖2表示本發(fā)明018血清型特異引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢測了 6株弧 菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖3表示本發(fā)明019血清型wzm基因P3和P4引物檢測霍亂弧菌其他血清型標準菌株 電泳結(jié)果圖，wzm基因P3和P4引物的篩選，目的條帶為264bp，其余的血清型沒有任何條 帶。具體菌株信息見表2; 圖4表示本發(fā)明019血清型wzm基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶。具體菌株信息見表2 ; 圖5表示本發(fā)明023血清型rzz基因P5和P6引物檢測霍亂弧菌其他血清型標準菌株 電泳結(jié)果圖，rzz基因P5和P6引物的篩選，目的條帶為250bp，其余的血清型沒有任何條 帶，具體菌株信息見表2; 圖6表示本發(fā)明023血清型rzz基因P5和P6引物種特異性的鑒定；電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖7表示本發(fā)明012血清型rM基因P7和P8引物檢測霍亂弧菌其他血清型標準菌株 電泳結(jié)果圖，r湖基因P7和P8引物的篩選，目的條帶為262bp，其余的血清型沒有任何條 帶。具體菌株信息見表2; 圖8表示本發(fā)明012血清型rM基因P7和P8引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶。具體菌株信息見表2 ; 圖9表示分別用018, 019, 023和012特異引物擴增對應(yīng)血清型的電泳結(jié)果圖，具體菌 株信息見表2 ; 其中018、019、023、0 12、和負對照（-)表示相應(yīng)血清型引物擴增結(jié)果，第一個泳道H 和最后一個泳道是2000bpladdermarker。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件。其中霍亂弧菌來源于JapanCollectionofMicroorganisms (JCM)〇
[0022] 實施例1:基_組的提取 37°C營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)霍亂弧菌，收集細菌，提取基因組具體步驟如下： 用 500ul50mMTris-HCl(pH8. 0)和IOul0. 4MEDTA重懸細胞，37°C溫育 20 分鐘，然 后加入IOullOmg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時，再加入3ullOmg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酚 抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取上清 液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中?；蚪MDNA通過0. 4%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測。
[0023] 實施例2:序列破譯 提取霍亂弧菌各個血清型標準菌株的基因組，通過Solexapair-end測序技術(shù)對霍亂 弧菌各個血清型基因組進行全基因組測序獲得該血清型的序列，運用Blast及PSI-Blast 進行序列比對，采用TMHMM2.0program進行跨膜結(jié)構(gòu)預測，運用ClustalWprogram進行 序列對齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得霍亂弧菌各個血清型的〇抗原基因簇序列 及破譯結(jié)果。
[0024] 實施例3:引物設(shè)計 霍亂弧菌各個血清型的0抗原基因簇序列是本實驗室自測的，通過比對分析，我們選 取Blast比對結(jié)果identity和similarity值相對較低的基因特異區(qū)段設(shè)計引物。其中 018血清型的r從基因比對結(jié)果iden