一種用于快速鑒定腿端黑實蠅的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學與分子生物學領域，具體涉及一種用于快速鑒定腿端黑實蠅 的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 腿端黑實繩，拉丁學名為：BactroceraatrifemurDrew&Hancock，為桔小實繩復 合種之一（DrewandHancock，1994)，屬雙翅目Diptera實繩科Tephritidae果實繩屬 Bactrocera，是一種重要的入侵檢疫性害蟲。現(xiàn)今主要分布在馬來西亞，我國于2010年首 次截獲，暫未在我國分布（黃振等，2011)。
[0003] 腿端黑實蠅作為具有重大經(jīng)濟意義的檢疫性有害生物，其主要傳播途徑為：以卵、 幼蟲或蛹隨被害果傳播。由于我國的地理位置、氣候以及寄主等方面適合其生殖繁衍，成為 腿端黑實蠅的集中危害地區(qū)，致使許多果蔬類產(chǎn)品的生產(chǎn)受到影響，從而導致國內(nèi)外貿(mào)易 受到影響。因此，隨著國際貿(mào)易的日漸頻繁，合作領域不斷拓寬，在進出境的果蔬中經(jīng)常截 獲各種不同的實蠅幼蟲、卵或蛹，甚至為頭、胸、翅、足等殘體，如何快速準確的鑒別其是否 為腿端黑實蠅，從而保證我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，具有重要現(xiàn)實意義。
[0004] 由于對腿端黑實蠅的成蟲形態(tài)鑒別遠比對幼蟲、卵或蛹的鑒別容易，因此，為了保 證鑒定的準確性目前的檢疫監(jiān)管機構(gòu)，通常采用的腿端黑實蠅疫情的鑒別方法為形態(tài)學鑒 別方法，即：首先將截獲的實蠅幼蟲、卵或蛹在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲，然后通過觀察成蟲形態(tài)，而 鑒別其是否為腿端黑實蠅。該種鑒別方法存在的主要問題為：（1)將幼蟲、卵或蛹飼養(yǎng)為成 蟲，需要花費較長的時間，嚴重影響了果蔬進出口貿(mào)易的通關速度；（2)如果截獲果蔬中實 蠅的頭、胸、腹、翅、足等殘體，由于無法將上述殘體飼養(yǎng)為成蟲，因此，無法準確識別所截獲 的殘體是否為腿端黑實蠅的殘體，具有較大的鑒別局限性。
[0005] 因此，現(xiàn)有技術中，為了防止檢疫性實蠅傳入以及擴散，迫切需要一種可克服形態(tài) 學鑒別方法的不足、能夠快速準確鑒定腿端黑實蠅的鑒別方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用于快速鑒定腿端黑實蠅的種特異性 引物對、試劑盒及鑒定方法，能夠快速準確的對截獲的疑似腿端黑實蠅的幼蟲、卵、蛹，以及 頭、胸、翅、腹、足等殘體進行鑒別。
[0007] 本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供一種用于快速鑒定腿端黑實蠅的種特異性引物對，包括上游引物TF37 和下游引物TR480 ;
[0009]所述上游引物TF37的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；
[0010] 所述下游引物TR480的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供一種用于快速鑒定腿端黑實蠅的試劑盒，所述試劑盒包括以下引 物：
[0012] 上游引物TF37,其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；
[0013] 下游引物TR480,其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括PCR反應緩沖液中的至少一種；所述試劑盒還包括標 準陽性模板。
[0015] 本發(fā)明還提供一種采用權利要求1所述的種特異性引物對快速鑒定腿端黑實蠅 的方法，包括以下步驟：
[0016]S1，設計腿端黑實蠅的種特異性引物對；其中，所述腿端黑實蠅的種特異性引物對 包括上游引物TF37和下游引物TR480 ;
[0017] 其中，上游引物TF37的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；下游引物TR480的核苷 酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0018]S2,提取被鑒定生物體的DNA;
[0019]S3,以S2提取的DNA為模板，使用Sl得到的所述腿端黑實蠅的種特異性引物對進 行SS-PCR擴增反應；
[0020] S4,采用電泳檢測SS-PCR擴增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴增產(chǎn)物是否含有444bp的 特征條帶，如果含有，則所述被鑒定生物體為腿端黑實蠅種；反之，則所述被鑒定生物體不 為腿端黑實蠅種。
[0021] 優(yōu)選的，Sl中，通過以下方法設計得到腿端黑實蠅的種特異性引物對：
[0022] SI. 1，選用腿端黑實蠅的標本，采用試劑盒法從所述腿端黑實蠅的標本中提取腿 端黑實蠅的基因組DNA。
[0023] 優(yōu)選的，S2中，所述被鑒定生物體的DNA具體為：來自卵生物形態(tài)的DNA、來自幼蟲 生物形態(tài)的DNA、來自蛹生物形態(tài)的DNA、來自生物殘體的DNA ;
[0024] 其中，所述生物殘體指頭、胸、腹、翅或足；
[0025] 此外，通過以下方法，提取被鑒定生物體的DNA:
[0026] 選用整只腿端黑實蠅、或腿端黑實蠅的殘體、或腿端黑實蠅的卵、幼蟲或蛹作為 樣本；將所選用的樣本置于2ml離心管中，加入液氮充分研磨；然后，將研磨后的樣本采用 OMEGAE.Z.N.A.?InsectDNAKit試劑盒法提取DNA，并將最終提取到的DNA保存于-20°C 備用。
[0027] 優(yōu)選的，S3中，所述SS-PCR擴增的反應體系以25ul計，包括：
[0028]
[0029]優(yōu)選的，所述SS-PCR擴增的反應條件為：93~95°C預變性4~6min ;93~95°C變性35~45s ;退火溫度50~60°C，25~35s ;72°C延伸0. 5~I. 5min ;20~30個循環(huán)， 最后72°C延伸7~IOmin停止反應。
[0030] 優(yōu)選的，所述SS-PCR擴增的反應條件為：94°C預變性5min;94°C變性40s;退火溫 度55°C，30s;72°C延伸Imin;30個循環(huán)，最后72°C延伸7min停止反應。
[0031] 優(yōu)選的，S4中，所述采用電泳檢測SS-PCR擴增產(chǎn)物，判斷所述SS-PCR擴增產(chǎn)物是 否含有444bp的特征條帶，具體為：
[0032]S4. 1，提取SS-PCR擴增后的 5ulSS-PCR產(chǎn)物；
[0033] S4. 2,在含DNA染色劑的1. 5%的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上，對所述5ulSS-PCR 產(chǎn)物120V電泳30min;
[0034] S4. 3,利用凝膠成像分析儀檢測電泳后是否擴增出444bp的特征條帶。
[0035] SS-PCR產(chǎn)物測序：除了對SS-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查腿端黑實蠅特異 引物擴增的特異片段是否與預期的一致外，本發(fā)明人還對特異引物的SS-PCR產(chǎn)物進行測 序，測序結(jié)果如下：
[0037] 本發(fā)明提供的用于快速鑒定腿端黑實蠅的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法， 具有以下優(yōu)點：
[0038] (1)種特異性引物對更加特異，只對腿端黑實蠅具有擴增能力，可擴增出一條長度 為444bp的特異條帶，而對其近源種無擴增能力，擴增效率更高，結(jié)果判斷更加直觀、便捷；
[0039] (2)PCR檢測技術操作簡單、快速、高效，一般可在8個小時內(nèi)完成檢測與鑒定，傳 統(tǒng)形態(tài)學鑒定中，需要飼養(yǎng)15天得到成蟲再進行鑒定；可見，本發(fā)明大大縮短了腿端黑實 蠅的鑒定周期；
[0040] (3)本發(fā)明提供的種特異性引物對，具有較高的靈敏度，DNA濃度檢出限為 4. 517X10 3ng/uL，具有較高的實用價值，可以快速、準確、特異性地檢測出腿端黑實蠅的各 個蟲態(tài)甚至殘體，具有檢測范圍大的優(yōu)點。
[0041] 可見，本發(fā)明所建立的SS-PCR快速鑒定腿端黑實蠅的方法，具有快速簡便、特異 性尚、靈敏度尚等優(yōu)點，可以在8小時之內(nèi)完成腿端黑實繩的鑒定，能夠滿足口岸檢驗檢疫 快速通關的要求。
【附圖說明】
[0042] 圖1為比較例一提供的通用型引物LC01490和HC02198對提取的實蠅DNA模板進 行質(zhì)量檢測的結(jié)果圖；
[0043] 圖2為比較例一提供的引物TF37和TR480的種特異性驗證結(jié)果圖；
[0044] 圖3為比較例三提供的引物TF37和TR480的種特異性驗證結(jié)果圖；
[0045] 圖4為試驗例一提供的引物TF37和TR480的靈敏度驗證結(jié)果。
【具體實施方式】
[0046] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細說明：
[0047] 近年來，由于分子生物學技術能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法難以解決的問題且不 受蟲態(tài)的影響，越來越多的分子生物學技術被運用于昆蟲的鑒定中（黃可輝等，2005 ;王 振華等，2009)。種特異引物PCR(Species-specificPCR，SS-PCR)技術，即在設計目標物 種的引物時必須充分考慮引物的特異性，使得在擴增未知模板時能夠根據(jù)目標片段條帶的 有無，就能把目標種類與其他種類鑒別開來。本發(fā)明提供了一種用于快速鑒定腿端黑實蠅 的種特異性引物對、試劑盒及鑒定方法，能夠快速可靠的對截獲的疑似腿端黑實蠅的幼蟲、 卵、蛹，以及頭、胸、翅、足等殘體進行鑒別。具有檢測結(jié)果可靠、靈敏度高、對腿端黑實蠅特 異性尚的優(yōu)點。
[0048] 以下通過具體的比較例或試驗例，證明本發(fā)明提供的種特異性引物對的特異性、 靈敏度和可靠性：
[0049] 比較例一