一種利用TaqMan探針檢測桔小實蠅的方法及檢測用引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用TaqMan探針檢測桔小實蠅的方法，包括以下步驟：（1）設計引物和探針：上游引物序列見SEQ ID No：1，下游引物序列見SEQ ID No：2，探針序列見SEQ ID No：3；（2）采用步驟（1）設計的引物和探針進行熒光定量PCR檢測。通過設計特異性引物和TaqMan探針，建立檢測桔小實蠅的方法，可快速、準確地檢測出桔小實蠅。
【專利說明】
-種利用TaqMan探針檢測枯小實蝸的方法及檢測用引物和 探針
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及一種利用化qMan探針檢測枯小實蛹的方法及 檢測用引物和探針。
【背景技術】
[0002] 枯小實蛹Bactrocera dorsalis,又名東方果實蛹Oriental fruit fly、黃蒼蛹、 果姐，屬雙翅目（Diptera)、實蛹科（Tephritidae)、果實蛹屬Bactrocera，為世界性檢疫害 蟲中的一種?？菪嵱荚a(chǎn)于中國的臺灣和日本的琉球群島一帶，而后陸續(xù)傳到周邊的20 多個國家和地區(qū)，在我國現(xiàn)主要分布于四川、重慶、貴州、云南、湖南、湖北、廣西、陜西、臺灣 等省市。枯小實蛹為雜食性害蟲，寄主范圍非常廣泛，W熱帶和亞熱帶的果蔬為主，可危害 包括番石惱、芒果、香蕉、相橘等46個科250多種水果、蔬菜和花弁，它對各種寄主的選擇偏 好有著明顯差異，對番石惱、芒果、楊桃、蒲桃、沙田抽等水果的為害最為嚴重?？菪嵱贾?要W幼蟲鉆蛙果實為害，成蟲將卵產(chǎn)于果皮內(nèi)，卵解化后，幼蟲即潛居果飄內(nèi)取食，造成果 實腐爛或未熟先黃而脫落，嚴重影響了水果的產(chǎn)量與質量，給果蔬業(yè)及果蔬的對外貿(mào)易帶 來巨大的經(jīng)濟損失，傳播方式主要是幼蟲隨瓜果、蔬菜的運輸來進行傳播。因此，加強瓜果、 蔬菜的調運檢疫顯得尤其重要，從源頭上堵住疫情的傳播渠道，同時還要建立快速，準確的 枯小實蛹方法。為保護中國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)安全，必須制定嚴格的檢驗檢疫制度和防除 措施，W防止枯小實蛹的傳播，而檢測方法則是影響水果進出口貿(mào)易通關速度和時間的關 鍵，因此對其檢測方法的研究極其重要。主要檢測方法：（1)形態(tài)鑒定檢測：早期對枯小實蛹 的鑒定主要應用傳統(tǒng)的成蟲形態(tài)鑒定方法。而通常口岸或其他渠道截獲的大部分是幼蟲或 卵，通常的做法是室內(nèi)飼養(yǎng)獲得成蟲后，再進行形態(tài)鑒定。通常飼養(yǎng)成蟲需要較長的時間， 實蛹形態(tài)鑒定的周期一般情況下約需15~25天，檢測周期較長，因此傳統(tǒng)的成蟲形態(tài)鑒定 并不利于口岸快速檢驗通關的實際需求；（2)聲波檢測:不同的聲波頻譜特征反映了各種蟲 聲所特有的信息。邱友德等通過對芒果內(nèi)枯小實蛹幼蟲為害聲波進行測試錄音，將運些錄 音蟲聲進行頻譜分比較，從已得出的蜜相大實蛹幼蟲為害聲2個樣本頻譜分析顯示出一定 的模式，但聲波檢測中關于器械靈敏度與抗外界噪聲干擾的矛盾問題，一直成為該技術發(fā) 展的一個瓶頸；（3)分子檢測:害蟲的分子鑒定具有快速、準確、客觀和對樣品要求低等諸多 特點，可對形態(tài)鑒定起補充作用。分子檢測鑒定實蛹類害蟲的方法很多，各有千秋，Lu-KH等 利用RAPD技術從實蛹類害蟲中找出特異帶，并對特異帶進行篩選、純化、測序，然后根據(jù)序 列設計特異引物來區(qū)分枯小實蛹、瓜實蛹和南瓜實蛹等幾類實蛹類害蟲;張亮等篩選得出 的5個引物對枯小實蛹及其幼蟲W及番石惱實蛹及其幼蟲的基因組DNA擴增結果基本一致， 所建立的指紋圖譜可W作為6個種各蟲態(tài)的鑒定依據(jù)，試驗結果穩(wěn)定、可靠，可對6種實蛹近 緣種類進行鑒定區(qū)分;孔秋蓮等利用特異性嵌套式PCR引物對枯小實蛹的rDNA基因片段進 行擴增，通過進一步序列分析，確定該蟲與其近緣種的關系，并能確定樣本的種屬關系，該 試驗建立的分子鑒定體系，可應用于口岸微量枯小實蛹卵快速、準確檢驗;張紅梅等用RAPD 技術對陜西省常見的4種實蛹進行了研究，試驗篩選出的5種RAPD引物S61、S107、S126、 S275、S1142,可W對4種實蛹基因組DNA擴增出穩(wěn)定清晰的多態(tài)性片段，其中RAPD引物S126 可W把南瓜實蛹和具條實蛹、具條實蛹和S點棍腹實蛹分開，利用UPGMA法聚類后構建的發(fā) 育系統(tǒng)樹與傳統(tǒng)分類結果完全一致。W上研究結果對開發(fā)枯小實蛹快速可靠的分子檢測新 技術提供了很好的參考作用。
[0003] 自90年代化qMan探針誕生W來，雖然巧光探針（引物)不斷有新的技術出現(xiàn)，但是 作為一種經(jīng)典的定量PCR技術，TaqMan探針技術仍然是許多實驗研究人員進行定量檢測的 首選，運主要是因為相對于SYBR巧光染料，TaqMan探針具有序列特異性，只結合到互補區(qū)， 而且巧光信號與擴增的拷貝數(shù)具有一一對應的關系，因此特異性強靈敏度高，而且條件優(yōu) 化容易；而相對于雜交探針，TaqMan探針只要設計一條探針，因此探針設計較便宜方便，而 且也能完成基本的定量PCR要求。一般化qMan定量PCR實驗過程為：目的基因查找比對^探 針與引物設計^探針與引物合成^配置反應體系^反應參數(shù)^重復實驗，優(yōu)化條件^獲得 曲線數(shù)據(jù)，比對標準曲線^再重復驗證。但檢測枯小實蛹的化qMan探針未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種利用化qMan探針檢測枯小實蛹 的方法及檢測用引物和探針，利用該引物和探針可快速、準確地對枯小實蛹進行檢測鑒定。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明的一方面，提供一種利用化qMan探針檢測枯小實蛹的方法，包括W下步驟：
[0007] (1)設計引物和探針：
[000引引物序列為：
[0009] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGATATT-3'（沈Q ID No:l);
[0010] 下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'（SEQ ID No:2);
[0011 ] I^qMan探針的序列：5 'FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-B冊3 '（ SEQ ID No: 3);
[001。 其中FAM為標記在探針5 '端的巧光集團，B冊為標記在探針3 '端的巧光澤滅集團；
[0013] (2)采用步驟(1)設計的引物和探針進行巧光定量PCR檢測。
[0014] 步驟（2)中巧光定量PCR檢測的反應體系為10化，包括2X化qMan probe Supermix 化L，上、下游引物各0.化L，化qMan探針0.化L，DNA模板0.化L，去離子水補至10化。
[001引步驟(2)中巧光定量PCR檢測的反應程序為:95°C預變性10min，95°C變性10s，55.8 °C退火20s(采集巧光信號），40個循環(huán)。
[0016] 本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測枯小實蛹的引物，其序列為：
[0017] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGATATT-3' ；
[001 引下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 '。
[0019] 本發(fā)明的第S方面，提供一種用于檢測枯小實蛹的化qMan探針，其序列為:5'FAM- TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-BHQ3 ' ；其中FAM為標記在探針5 '端的巧光集團，B冊為標記在 探針3'端的巧光澤滅集團。
[0020] 本發(fā)明提供的一種利用化qMan探針檢測枯小實蛹的方法及檢測用引物和探針，具 有W下有益效果:該引物和探針容易設計，特異性好，穩(wěn)定性高，重復性強，靈敏度高，檢測 方法簡單有效，易操作，檢測時間短，準確率高，可快速、準確地檢測出枯小實蛹。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為不同退火溫度的Ct值結果圖；
[0022] 圖2為特異性實驗擴增曲線圖；
[0023] 圖3為6個10倍系列稀釋樣品的巧光定量PCR擴增曲線；
[0024] 圖4為重復性實驗擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0025] 實施例1
[00%] 1、樣品模板:6份已知物種的實蛹DNA，編號分別為：1，2,3,4,5,6，樣品名稱分別為 枯小實蛹、番石惱實蛹、具條實蛹、南瓜實蛹、川黑實蛹和瓜實蛹，其中前五個種類由四川國 際旅行衛(wèi)生保健中屯、口岸實驗室提供，瓜實蛹由華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院昆蟲教研室提 供，具體見表1。
[0027]表1樣品信息 [002引
[0029] 2、一種利用化qMan探針檢測枯小實蛹的方法，包括W下步驟：
[0030] (1)設計引物和探針：
[0031] 引物是根據(jù)枯小實蛹DM特異片段設計的：根據(jù)枯小實蛹線粒體DM序列 (Genebank accession numbe;r:NC_008748)，使用Beacon Desi即er 6軟件設計其引物和探 針序列，并將設計的引物和探針在NCBI Blast比對，確認為枯小實蛹特異性序列；
[0032]引物序列為：
[0033] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGATATT-3' ；
[0034] 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 ' ；
[0035] I^qMan探針的序列：5 ' FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-B冊3 ' ；
[0036] 其中FAM為標記在探針5'端的巧光集團，B冊為標記在探針3'端的巧光澤滅集團；
[0037] (2)采用步驟(1)設計的引物和探針進行巧光定量PCR檢測:反應體系為10化，包括 2 X^qMan probe Supermix化L，上、下游引物各0.化L(引物終濃度分別為200nmol/L)， 化qMan探針0.化L(探針終濃度為lOOnmol/L)，DNA模板0.扣L，去離子水補至10化;反應程序 為:95 °C預變性IOmin，95 °C變性10s，合適溫度退火20s (采集巧光信號），40個循環(huán)。
[0038] 實施例2巧光定量PCR實驗中退火溫度的優(yōu)化
[0039] 選取的退火溫度分別為：55.8 °C、56.8 °C、57.8 °C、58.8 °C，觀察其差異，不同的退 火溫度，其循環(huán)闊值(Ct)結果見表2和圖1。
[0040] 表2不同退火溫度時的Ct值 r 00411
[0042] 由結果可知，同一濃度的番石惱實繩DNA模板在不同的退火溫度下，其循環(huán)闊值 (Ct)不同，退火溫度為55.8°C時，循環(huán)闊值最小，因此，最優(yōu)的退火溫度為55.8°C。
[0043] 實施例3特異性和敏感性實驗
[0044] 特異性實驗：W枯小實蛹DNA模板為陽性對照，W實施例1中的檢測方法結合實施 例2中退火溫度，對6個樣品的DNA模板進行巧光定量PCR檢測，檢測結果見圖2;
[0045] 由圖2可知，僅有枯小實蛹出現(xiàn)了特異性擴增，其余5種實繩并沒有出現(xiàn)擴增，說明 該檢測方法特異性良好。
[0046] 敏感性實驗:將枯小實蛹DNA(原濃度為l(K)ngAiL)進行10倍系列稀釋，稀釋6次，每 個稀釋樣品取化L作為模板進行巧光定量PCR檢測，檢測結果見表3和圖3。
[0047] 表3 10倍系列稀釋樣品檢測結果 rnru 只 1
[0049]當模板濃度在0.0 Ol-IOOng/化時，與相應的Ct值有良好的相關性，相關系數(shù)為 0.998，可信度為0.99559，結果表明，TaqMan探針可對DNA濃度>0 . OOlngAiL的枯小實蛹進 行精確定量。
[0化日]實施例4重復性實驗
[0051]為檢測化qMan探針定量的重復性和穩(wěn)定性，對同一濃度（12. SngAiL)的10個枯小 實蛹DNA模板進行重復性實驗，其Ct值結果見表4和圖4。
[0化2]

[0053]重復性擴增曲線顯示該方法重復性好，由統(tǒng)計結果可知，10個模板的重復性實驗 標準差為0.47，表明該方法重復性良好而且穩(wěn)定。

【主權項】
1. 一種利用TaqMan探針檢測桔小實蠅的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 設計引物和探針： 引物序列為： 上游引物序列：5 ' -GCTAATTCATCTGTAGATATT-3 ' ； 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 ' ； TaqMan探針的序列：5 'FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-BHQ3 ' ； 其中FAM為標記在探針5'端的熒光集團，BHQ為標記在探針3'端的熒光淬滅集團； (2) 采用步驟(1)設計的引物和探針進行熒光定量PCR檢測。2. 根據(jù)權利要求1所述的利用TaqMan探針檢測桔小實蠅的方法，其特征在于，步驟(2) 中所述焚光定量PCR檢測的反應體系為10yL，包括2 XTaqMan probe Supermix 5yL，上、下 游引物各〇 · 4μ L，TaqMan探針0 · 2μ L，DNA模板0 · 5μ L，去離子水補至1 Ομ L。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的利用TaqMan探針檢測桔小實蠅的方法，其特征在于，步驟 (2)中所述熒光定量PCR檢測的反應程序為:95°C預變性10min，95°C變性10s，55.8°C退火 20s采集熒光信號，40個循環(huán)。4. 一種用于檢測桔小實蠅的引物，其特征在于，序列為： 上游引物序列：5 ' -GCTAATTCATCTGTAGATATT-3 ' ； 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 '。5. -種用于檢測桔小實蠅的TaqMan探針，其特征在于，序列為：5 'FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-BHQ3 ' ；其中FAM為標記在探針5 '端的熒光集團，BHQ為標記在 探針3'端的熒光淬滅集團。
【文檔編號】C12N15/11GK105925702SQ201610407483
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】林丹, 李楠, 趙峰, 林鳳, 陳琳
【申請人】成都丹鳳科技有限公司