一種青霉素g?；傅耐蛔凅w及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及酶工程領域，具體內(nèi)容涉及青霉素G?；傅耐蛔凅w及其 制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 青霉素是世界上第一只應用于臨床的抗感染類藥物。長期以來，青霉素在 抗生素市場上長盛不衰，已成為全球廣泛應用的一線抗菌藥物。6-氨基青霉烷酸 (6_amin〇-penicillanicacid，6_APA)是合成氨節(jié)西林和阿莫西林的一種重要中間體。工 業(yè)上生產(chǎn)6-APA的方法有化學裂解法和酶法兩種方法，其中化學裂解法由于成本較高、工 藝步驟多、三廢嚴重和條件苛刻等缺點已逐步被淘汰；而酶法具有成本較低、工藝簡單、綠 色無污染及反應條件溫和等優(yōu)點，因此日益受到重視。
[0003] 當前，(6-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)生產(chǎn)6-APA主要是利用青霉素G?；?(penicillinGacylase，PGA，EC3. 5. 1. 11)水解青霉素來獲得，其反應原理是：青霉素G ?；笇⑶嗝顾谿水解為6-APA和苯乙酸，具體反應如下所示。
[0005] 青霉素G?；竵碓词謴V泛，許多微生物來源的PGA被國內(nèi)外科研工作者篩 選、克隆并表達出其編碼的基因，如中國專利CN1464055中，姜衛(wèi)紅、趙國屏等從黃桿菌 (Flavobacteriumsp. 650)中克隆并表達出一種新型青霉素G?；?，在生成6-APA實驗 中測定其比活力達到48. 5U/mg;中國專利CN1544635中，袁中一、楊志建等從糞產(chǎn)堿桿菌 (Alcaligenesfaecalis)中克隆出AfPGA基因并進行重組表達，發(fā)酵活性達到3500U/L;中 國專利CN103184182中，何冰芳、孔佳佳等篩選到一株產(chǎn)青霉素G?；傅哪咎茄趸療o色桿 菌（Achromobacterxylosoxidans)K18,其發(fā)酵活性達到 200U/L;歐洲專利EP2109672 中， 發(fā)明人從Achromobactersp.CCM4824中克隆出長為2646bp編碼青霉素G?；富?，并 成功的在大腸桿菌中進行了重組表達等。
[0006] 隨著基因工程和蛋白工程技術的發(fā)展，對青霉素G酰化酶的突變改造有很多報 道，但是它們的改造目的都集中在提高PGA的合成活力以及合成水解比（S/H)，而對青霉 素G的催化水解活性的改造提高鮮有報道。到目前為止，僅有一篇文獻對青霉素G?；?酶水解活性進行改造的報道，即HuseyinBalci，MerveTuzlakogluOzturk等（Applied MicrobiologyandBiotechnology，Volume98,Issue10,pp4467-4477)利用易錯PCR技 術結合高通量篩選方法，對大腸埃希氏菌ATCC11105來源的PGA進行突變，其突變體M2234 僅有一個氨基酸（K297I)發(fā)生改變，其比活力就比野生型PGA提高了 4倍同時該突變體在 PH10. 0的條件下表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。
[0007] 目前，在原料藥企業(yè)應用酶法生產(chǎn)6-APA的過程中發(fā)現(xiàn)，由于青霉素G酰化酶催化 活性低、苯乙酸抑制強、反應時間長、底物抑制等缺點，導致6-APA產(chǎn)量不能迅速提升，因此 開發(fā)高活性，高反應速率，高轉(zhuǎn)化率，高濃度底物耐受性，高濃度苯乙酸耐受性，低底物殘留 的"五高一低"的新型青霉素G?；敢哑仍诿冀蕖?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種高活性青霉素G?；竿蛔凅w，其在SEQIDNO. 2 的埃希氏大腸桿菌ATCC11105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A上，有如下六個位點 中的一個點突變或多點組合突變：第748位氨基酸由D突變?yōu)閂，第209位氨基酸由T突變 為S，第179位氨基酸由L突變?yōu)镕，第206位氨基酸由N突變?yōu)镈，第506位氨基酸由N突 變?yōu)镈，第602位氨基酸由T突變?yōu)镼。
[0009] 所述的青霉素G?；竿蛔凅w，優(yōu)選在SEQIDNO. 2的埃希氏大腸桿菌ATCC11105 野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A上對第748位和/或第209位上的氨基酸進行取代。 第748位和第209位上的氨基酸同時進行取代得到的PGA-2更好。此外，第748位氨基酸 還能由D突變?yōu)镋。
[0010] 所述的青霉素G?；竿蛔凅w，進一步優(yōu)選在PGA-2的氨基酸序列基礎上對第179 位和/或第206位上的氨基酸進行取代得到，PGA-2是在SEQIDNO. 2的埃希氏大腸桿菌 ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基礎上對第748位和第209位上的氨基酸同 時進行取代得到，其由SEQIDN0:4所示的氨基酸序列組成。第179位和第206位上的氨 基酸同時進行取代得到的PGA-4更好。此外，第206位氨基酸還能由N突變?yōu)镼或K，優(yōu)選 第206位氨基酸由N突變?yōu)镵。
[0011] 所述的青霉素G?；竿蛔凅w，更進一步優(yōu)選在PGA-4的氨基酸序列基礎上對第 506位和/或第602位上的氨基酸進行取代得到，PGA-4是在SEQIDNO. 2的埃希氏大腸桿 菌ATCC11105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A上對第748位、第209位、第179位和 第206位上的氨基酸同時進行取代得到，其是由SEQIDN0:6所示的氨基酸序列組成。第 602位氨基酸還能由T突變?yōu)镈或G，優(yōu)選第602位氨基酸由T突變?yōu)镚。
[0012] 所述的青霉素G?；竿蛔凅w，最優(yōu)選是在SEQIDNO. 2的埃希氏大腸桿菌 ATCC11105野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A上，有如下六個位點組合突變：第748位 氨基酸由D突變?yōu)閂，第209位氨基酸由T突變?yōu)镾，第179位氨基酸由L突變?yōu)镕，第206 位氨基酸由N突變?yōu)镈，第506位氨基酸由N突變?yōu)镈，第602位氨基酸由T突變?yōu)镼，其是 由SEQIDN0:8所示的氨基酸序列組成。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述的青霉素G?；竿蛔凅w的核苷酸序列，為以下 的任一種：
[0014] 1)上述青霉素G?；竿蛔凅w中的任一種的核苷酸序列；
[0015] 2)在嚴格條件下與1)中任一項限定的核苷酸序列雜交且編碼具有青霉素G?；?酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
[0016] 3)與1)或2)中任一項限定的基因序列具有90%以上的同源性且編碼具有青霉 素G酰化酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述的青霉素G?；傅耐蛔凅w的應用，用于將青霉 素G水解為6-APA和苯乙酸。
[0018] 本發(fā)明的第四個目的是提供上述的突變型青霉素G?；傅闹苽浞椒?，包括以下 步驟：
[0019] a)將具有序列表中SEQ ID NO. 1的埃希氏大腸桿菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰 化酶核苷酸序列進行隨機突變、飽和突變、迭代飽和突變等步驟得到編碼上述任一種青霉 素G酰化酶的突變體的基因序列；
[0020] b)將突變體基因序列插入到質(zhì)粒中得到表達載體；
[0021] c)將表達載體轉(zhuǎn)化進入菌株中得到重組基因工程菌；
[0022] d)將重組基因工程菌用乳糖誘導進行發(fā)酵得到青霉素G?；?。
[0023] 本發(fā)明涉及的突變型青霉素G?；傅闹苽浞椒ǎM一步地，還包括純化步驟，純 化步驟為將產(chǎn)青霉素G?；钢亟M菌破碎、離心、收集后通過固定化金屬螯合親和層析法 進行純化得到青霉素G?；讣兠?。
[0024] 進一步地，還包括酶的固定化步驟，固定化步驟為將上述純化后的酶液，用磷酸鹽 緩沖液（pH8.0、0.lmol/L)溶解，然后加入50g經(jīng)活化處理后的載體，于25°C、120rpm條件 下低速攪拌固定化48h，將所得固定化酶用去離子水反復清洗3~5遍，真空濾干后即得固 定化酶終產(chǎn)品。
[0025] 進一步地，固定化載體為環(huán)氧基載體ECEP或氨基載體ECHA/S。
[0026]進一步地，質(zhì)粒為pET30a(+)，菌株為E.coli BL21(DE3)。
[0027] 本發(fā)明的另一方面還提供了一種由固定化青霉素G?；噶呀馇嗝顾谿制備 6-APA的方法，其轉(zhuǎn)化條件為：底物青霉素G濃度（W/V)為8 %~30 %，優(yōu)選為15 %~30 %，更優(yōu)選為25%，轉(zhuǎn)化溫度為20~25°C，pH為8. 0~8. 2。
[0028] 本發(fā)明優(yōu)勢：
[0029] 本發(fā)明通過隨機突變、飽和突變、迭代飽和突變等非理性及半理性設計的酶工程 改造技術對大腸埃希氏菌ATCC11105來源的PGA進行突變，獲得了反應活性更高，反應速 率更快，轉(zhuǎn)化率更好，青霉素G濃度耐受性更強，底物殘留更少，苯乙酸濃度耐受性進一步 提高的PGA突變體，可以更有效，快速地將青霉素G轉(zhuǎn)化為6-APA。
[0030] 除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。 下面將參照附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
【附圖說明】
[0031] 構成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實 施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：
[0032] 圖1是本發(fā)明優(yōu)選實施例中的青霉素G酰化酶突變體的制備流程圖；
[0033] 圖2是本發(fā)明優(yōu)選實施例的SDS-PAGE圖譜；
[0034]圖3是本發(fā)明實施例3的PGA裂解青霉素G制備6-APA的HPLC圖，具體為突變型 PGA-6固定化酶制備6-APA的HPLC圖，其中青霉素G的轉(zhuǎn)化率可達98%以上。
【具體實施方式】
[0035] 實施例
[0036] 1、下述實施例中所使用的方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，如《分子克隆實驗指 南》（J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京：科學出 版社，2002)中所述的方法進行。引物、全基因合成以及序列測序均為泰和永昌（長沙）生 物技術有限公司完成。大腸桿菌宿主菌為E.coliBL21(DE3)購于Merck公司，大腸桿菌宿 主菌還可以是E.coliBL21(DE3)plys，購于天根公司，原核表達載體pET30a(+)購于Merck 公司。DNA內(nèi)切酶Hi