地塞米松，5 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.25nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸。
[0031]實施例4:
步驟一、脂肪層的構(gòu)建
1、P6代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)消化，于800rpm/min條件下離心5min。用含體積比10%胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，每孔0.25Ε6密度接種至Transwell小室，小室內(nèi)液量150 μ 1,5% CO2、37 °C孵箱中培養(yǎng)；
2、24h后更換培養(yǎng)液，棄去小室內(nèi)外的a-MEM培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150 μ 1，5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)5d，每隔2d換液；
3、5d后，重復(fù)步驟l，24h后更換小室內(nèi)外培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)4d，每隔24h更換小室內(nèi)液體，加液量同上。
[0032]成脂誘導(dǎo)液組成:a -MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，其中添加體積比為10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.05mg/ml，IBMX 0.2mg/ml，胰島素 0.02 mg/ml，地塞米松 0.1 μ g/ml。
[0033]步驟二、真皮層的構(gòu)建:
1、P6代成纖維細(xì)胞消化后，于800rpm/min條件下離心5min。在含有35μ g/ml Vc以及體積比為10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.25Ε6密度接種至步驟一的脂肪層，保證小室內(nèi)液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)；
2、24h后，重復(fù)步驟1，在5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)2d，每隔24h換液，保證小室內(nèi)液量150 μ 10
[0034]步驟三、表皮層的構(gòu)建:
1、Ρ5代表皮細(xì)胞培養(yǎng)融合率達(dá)60%左右，消化后于800rpm/min條件下離心8min，用構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl重懸，以3.0E5/孔的細(xì)胞密度接種至步驟二的真皮層中。其中，SKcl階段為液下培養(yǎng)方式，保證小室內(nèi)液量150 μ 1，于5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)，每24h換液一次；
2、培養(yǎng)3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2培養(yǎng)液，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，將步驟I中Transwell小室的培養(yǎng)液吸去，保持人工皮膚表面的干燥，隨后5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)3d，每24h換液一次；
3、3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc3，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)3d，每24h換液一次；
4、3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc4，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)2d，每24h換液一次；
不同構(gòu)建用液的所含成分具體如下:
構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM 構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為10%的胎牛血清(FBS)，0.5ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸；
構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25 mM 的 CaC12，0.5 ng/ml 的 EGF，55 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L的胰島素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸；構(gòu)建培養(yǎng)液SKc3是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為10%的胎牛血清(FBS)，添加0.5mM 的 CaC12，0.5 ng/ml 的 EGF，55 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.2nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸；培養(yǎng)液SKc4是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比為10%的胎牛血清(FBS)，添加ImM的CaC12，0.5ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.2nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸。
[0035]由此，不難看出，以上各實施例所提供的用于體外替代測試的全層皮膚是含有脂肪層的人工皮膚，具有三層皮膚結(jié)構(gòu)，自上而下分別為表皮層，真皮層，脂肪層。表皮層由表皮細(xì)胞生發(fā)復(fù)層化組成，厚度約為150?200Mm ;真皮層由成纖維細(xì)胞及其胞外基質(zhì)組成，厚度約40.0?60.0Mffl ;脂肪層由脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞及胞外基質(zhì)組成，厚度約為10.0?20.0Mm。其中，表皮層通過表皮細(xì)胞在特殊的氣液面培養(yǎng)條件下(即以上各實施例所述的培養(yǎng)方式)生發(fā)成類似正常人體皮膚的表皮樣結(jié)構(gòu)；真皮層構(gòu)建時不添加任何外源支架結(jié)構(gòu)，通過多次細(xì)胞接種法分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)成厚度約40.0?60.0Mffl的真皮層厚度，除保證同人體正常皮膚結(jié)構(gòu)的高度相似，還可滿足表皮層生發(fā)時所需營養(yǎng)；脂肪層是在三維培養(yǎng)條件下，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，使之誘導(dǎo)分化為可形成脂滴的脂肪細(xì)胞，同時細(xì)胞通過增殖及胞外基質(zhì)分泌作用復(fù)層化形成。
[0036]而以上各實施例提供的用于體外替代測試的全層皮膚的制備過程具體通過以下步驟體現(xiàn):
步驟一、脂肪層的構(gòu)建
1.1)、將P3?P8代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞消化后，于800?1000 rpm/min條件下離心5?8min。在含體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接種至Transwell小室，保持小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?
5.5% C02、37±1°C的孵箱中培養(yǎng)；
1.2)、18?24h后更換培養(yǎng)液，棄去小室內(nèi)外的a -MEM培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%-5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)5?7d，每隔2?3d換液；
1.3)、5?7d后，重復(fù)步驟1.1)、，18?24h后更換小室內(nèi)外培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)2?4d，每隔18?24h更換小室內(nèi)液體，加液量同上；
成脂誘導(dǎo)液組成:a -MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，其中添加體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.01 ?0.05mg/ml，ΙΒΜΧ0.1 ?0.5mg/ml，胰島素 0.01 ?0.05 mg/ml，地塞米松 0.1 ~ 0.8 μ g/ml O
[0037]本步驟一是構(gòu)建含脂肪層的全層皮膚的關(guān)鍵步驟。本步驟采用從脂肪組織中提取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為脂肪層的種子細(xì)胞。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞首先易獲取且不易造成繼發(fā)缺損或者感染。從整形美容外科患者的腹部、上臂、大腿、臀部等部位抽出的脂肪組織均可分離；其次，從以上方式獲得的脂肪組織數(shù)量較大，可分離大量的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；最后，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)作用下同其它來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有更高的分化率。在上述步驟中，采用脂肪層的兩次接種，這樣處理的優(yōu)勢是保證在短期培養(yǎng)過程中脂肪層具有一定的結(jié)構(gòu)性，即能夠達(dá)到10.0?20.0Mffl厚度；其次首次接種細(xì)胞后，通過成脂誘導(dǎo)液的培養(yǎng)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞開始向脂肪細(xì)胞分化并形成脂滴結(jié)構(gòu)。
[0038]脂滴(Lipid Droplet)是脂肪細(xì)胞的主要成分，占據(jù)了脂肪細(xì)胞的大部分空間，月旨滴不僅是脂肪結(jié)構(gòu)性的指證，也是脂肪細(xì)胞具有功能性的標(biāo)志。因此被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功的指標(biāo)。在出現(xiàn)脂滴結(jié)構(gòu)后進(jìn)行第二次脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的接種，底層出現(xiàn)脂肪細(xì)胞的脂肪層所形成的微環(huán)境能夠加速二次接種細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，因此在短時間內(nèi)可形成含有大量脂滴的脂肪層。
[0039]步驟二、真皮層的構(gòu)建:
2.1)、P6?PlO代成纖維細(xì)胞消化后，于800?1000 rpm/min條件下離心5?8min。在含有25?75 μ g/ml Vc以及體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接種至步驟一的脂肪層，保證小室內(nèi)液量150?200 μ 1，
4.5% ?5.5% C02、37±1°C孵箱中培養(yǎng)；
2.2)、18?24h后，重復(fù)步驟2.1)、，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C孵箱中培養(yǎng)2?4d，每隔18?24h換液，保證小室內(nèi)液量150?200 μ I。
[0040]步驟二實現(xiàn)了真皮層無外源性支架的構(gòu)建，通過成纖維細(xì)胞自分泌作用獲得胞外基質(zhì)，形成真皮層骨架結(jié)構(gòu)。
[0041]2013年，國外學(xué)者David Janson只接種一次成纖維細(xì)胞，經(jīng)過3周培養(yǎng)形成真皮層結(jié)構(gòu)，此過程培養(yǎng)周期長，且培養(yǎng)要求較高。
[0042]因此使用真皮層成纖維細(xì)胞的兩次接種法，一方面人工縮短真皮層構(gòu)建周期，快速構(gòu)建真皮層結(jié)構(gòu)，另一方面避免真皮層長時間培養(yǎng)時因胞外基質(zhì)分泌，細(xì)胞受到機(jī)械牽拉所帶來的收縮問題。在培養(yǎng)過程中添加一定濃度的Vc，刺激成纖維細(xì)胞對胞外基質(zhì)的分泌，促進(jìn)真皮層結(jié)構(gòu)形成。
[0043]步驟三、表皮層的構(gòu)建:
3.1)、P4?P8代表皮細(xì)胞培養(yǎng)融合率達(dá)60?70%左右時，于800?1000 rpm/min條件下離心6?8min，用構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl重懸，以1.5?3.0E5/孔的細(xì)胞密度接種至步驟二的真皮層中。其中，SKcl階段為液下培養(yǎng)方式，保證小室內(nèi)液量150?200 μ 1，于4.5%?
5.5% C02、37±1°C孵箱中培養(yǎng)，每18?24h換液一次；
3.2)、培養(yǎng)2?3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，將步驟I中Transwell小室的培養(yǎng)液吸去，保持人工皮膚表面的干燥，隨后于4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培養(yǎng)2?3d，每18?24h換液一次；
3.3)、2?3d后，更換成SKc3構(gòu)建培養(yǎng)液，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培養(yǎng)2?3d，每18?24h換液一次；
3.4)、2?3d后，更換成SKc4構(gòu)建培養(yǎng)液，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培養(yǎng)I?2d，每18?24h換液一次； 不同構(gòu)建用液的所含成分具體如下:
構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，
培養(yǎng)液SKcl是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)，0.1?0.5ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 Thyroxine (T3)，4 ?10 μ g/ml 的維甲酸。
[0044]培養(yǎng)液SKc2是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25 ?0.5 mM 的 CaC12，0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml的地塞米松，3?25 μ g/L的胰