一種用于體外替代測試的全層皮膚模型及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及一種含脂肪層的全層皮膚模型及其制備方法，可以用于替代活體動物(及人體)的體外測試領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是人體最外的一層結(jié)構(gòu)，是人體最大的一個器官。除了承擔(dān)保護身體、排汗、感覺冷熱和壓力的生理功能外，也是外界物理性(紫外線、微波等)、機械性(牽拉、摩擦等)、化學(xué)性(化妝品、藥品，化學(xué)品等)刺激的主要作用器官。
[0003]傳統(tǒng)化妝品、藥品、原料篩選、生物制品、化學(xué)制品的皮膚安全性評價或功效性評價目前主要利用動物或人體皮膚作為檢測模型。隨著近年來世界各國對實驗動物福利問題的重視，歐洲各國、美國相繼頒布了動物福利法，旨在減輕或消除動物的疼痛，達到保護動物的目的。
[0004]歐洲、美國、日本等世界發(fā)達地區(qū)或國家已成立動物實驗替代機構(gòu)旨在積極推動替代方法進行更為系統(tǒng)而深入的研究，目前已順利完成相關(guān)技術(shù)儲備，并通過立法程序建立起相應(yīng)的技術(shù)性貿(mào)易措施體系。
[0005]我國現(xiàn)也已有和國際接軌的相關(guān)法律法規(guī)，以體外替代試驗方法取代傳統(tǒng)的動物試驗。GB/T16886-1《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第I部分:評價與試驗》提到:只要科學(xué)上證明能獲得與動物試驗同樣的信息，建議優(yōu)先采用體外模式。
[0006]在此背景下，以正常的人體皮膚生理結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)，利用組織工程原理和技術(shù)構(gòu)建的3D皮膚模型成為未來首選的生物學(xué)評價工具。
[0007]目前構(gòu)建的3D皮膚模型主要由表皮或真皮層組成。但是利用體外替代模型進行生物學(xué)評價的含有脂肪層的3D皮膚模型還少有報道。
[0008]皮膚由上而下可以分為:表皮層、真皮層以及皮下組織。皮下組織(Subcutaneous)又稱為“皮下脂肪組織”，位于真皮層下方，與真皮層無明顯的界限，解剖學(xué)上稱為淺筋膜，臨床上稱為蜂窩組織；其主要功能是吸收震動、阻隔熱、提供能量與熱量的來源、可以形成并儲存脂肪、進行脂肪代謝。
[0009]因此，現(xiàn)有的3D皮膚模型與正常皮膚組織結(jié)構(gòu)相比還存在以下幾個缺點:首先，不含有皮下組織，即皮下脂肪層；其次，現(xiàn)有的3D皮膚模型大都是在外源支架(目前以膠原為主)基礎(chǔ)上進行構(gòu)建，因此進行生物監(jiān)測時含有外源支架結(jié)構(gòu)的3D皮膚模型不能反映同活體皮膚類似的檢測數(shù)據(jù)。
[0010]2007年10月金巖等人申請了有關(guān)專利(中國專利申請?zhí)?00710018911.7)，該發(fā)明包括皮下脂肪細胞、成纖維細胞、表皮細胞和生物支架材料，主要應(yīng)用于燒燙傷、潰瘍等皮膚缺損患者的臨床治療，不能作為生物學(xué)評價的替代模型。
[0011]JULIE FRADETTE在2008年發(fā)表的文章[1]中介紹了一種含有脂肪層的全層皮膚模型，此模型的真皮層以I型膠原作為支架材料，構(gòu)建過程復(fù)雜，周期長，很難進行正常產(chǎn)業(yè)化，且在后期檢測中，外源性的支架結(jié)構(gòu)會對正常細胞間的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生影響，無法反應(yīng)同活體皮膚類似的檢測數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)提供的皮膚模型不能作為生物學(xué)評價的替代模型、構(gòu)建過程復(fù)雜，分化周期長，真皮層易收縮、功能性不完整、很難進行正常產(chǎn)業(yè)化，且在后期檢測中，外源性的支架結(jié)構(gòu)會對正常細胞間的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生影響，無法反應(yīng)同活體皮膚類似的檢測數(shù)據(jù)的問題。
[0013]為此，本發(fā)明提供了一種用于體外替代測試的全層皮膚模型，具有三層皮膚結(jié)構(gòu)，自上而下分別為表皮層，真皮層和脂肪層；
所述表皮層由表皮細胞生發(fā)復(fù)層化組成；
所述真皮層由成纖維細胞及其胞外基質(zhì)組成；
所述脂肪層由脂肪間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)而成的脂肪細胞及胞外基質(zhì)組成。
[0014]上述表皮層的厚度為150?200Mm ；
上述真皮層的厚度為40.0?60.0Mm ；
上述脂肪層的厚度為10.0?20.0Mm。
一種用于體外替代測試的全層皮膚模型的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、脂肪層的構(gòu)建
1.1)、將P3?P8代的脂肪間充質(zhì)干細胞消化后，于800?1000 rpm/min條件下離心5?8min ;在含體積比為5?10%胎牛血清FBS的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接種至Transwell小室，保持該Transwell小室內(nèi)的液量為150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培養(yǎng)；
1.2)、18?24h后棄去所述Transwell小室內(nèi)外的a -MEM培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液，保持所述Transwell小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)5?7d，每隔2?3d換液；
1.3)、5?7d后，重復(fù)步驟1.1)，18?24h后更換所述Transwell小室內(nèi)外培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，保持所述Transwell小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37±1°C孵箱中培養(yǎng)2?4d，每隔18?24h更換所述Transwell小室內(nèi)液體，保持所述Transwell小室內(nèi)液量150?200 μ I ；
所述成脂誘導(dǎo)液的組成:以a -MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，其中添加體積比分別為5?10%的胎牛血清FBS,吲哚美辛0.01?0.05mg/ml，IBMX0.1?0.5mg/ml，胰島素0.01?
0.05 mg/:ml，地塞米松 0.1 ?0.8 μ g/ml ；
步驟二、真皮層的構(gòu)建:
2.1)、P6?PlO代成纖維細胞消化后，于800?1000 rpm/min條件下離心5?8min ；在含有25?75 μ g/ml Vc以及體積比為5?10%的胎牛血清FBS的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接種至步驟一制備的脂肪層，保證所述Transwell小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)；
2.2)18?24h后，重復(fù)步驟2.1)，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)2?4d，每隔18?24h換液，保證所述Transwell小室內(nèi)液量150?200 μ I ；
步驟三、表皮層的構(gòu)建: 3.1)、待P4?P8代表皮細胞培養(yǎng)融合率達60?70%左右時，于800?1000 rpm/min條件下離心6?8min，用構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl重懸，以1.5?3.0E5/孔的細胞密度接種至步驟二制備的真皮層中；其中，SKcl階段為液下培養(yǎng)方式，保證所述Transwell小室內(nèi)液量150?200 μ 1，于4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)，每18?24h換液一次；
3.2)、培養(yǎng)2?3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2，并進行氣液面培養(yǎng)，將步驟3.1)中Transwell小室的培養(yǎng)液吸去，保持人工皮膚表面的干燥，隨后在4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培養(yǎng)2?3d，每18?24h換液一次；
3.3)、2?3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc3，并進行氣液面培養(yǎng)，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培養(yǎng)2?3d，每18?24h換液一次；
3.4)、2?3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc4，并進行氣液面培養(yǎng)，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培養(yǎng)I?2d，每18?24h換液一次；
不同構(gòu)建培養(yǎng)液所含成分具體如下:
構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM ；
所述構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為5?10%的胎牛血清FBS，
0.1 ?0.5ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰島素 INSULIN，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 ThyroxineT3, 4 ?10 μ g/ml 的維甲酸；
所述構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為5?10%的胎牛血清FBS，添加 0.25 ?0.5 mM 的 CaCl2,0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8μ g/ml的地塞米松，3?25 μ g/L的胰島素INSULIN，15?45 μ g/ml的腺嘌呤，0.1?0.5nM的ThyroxineT3，4?10 μ g/ml的維甲酸；所述構(gòu)建培養(yǎng)液SKc3是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為5?10%的胎牛血清FBS，添加0.5?ImM的CaCl2,0.1?0.5 ng/ml的EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰島素 INSULIN，15?45 μ g/ml的腺嘌吟，0.1?0.5nM的ThyroxineT3，4?10 μ g/ml的維甲酸；所述構(gòu)建培養(yǎng)液SKc4是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為5?10%的胎牛血清FBS，添加I?
1.5mM 的 CaCl2,0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的膜島素 INSULIN，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 ThyroxineT3，4 ?10 μ g/ml 的維甲酸。
[0015]綜上所述，本發(fā)明提供的含脂肪層全層皮膚(用于體外替代測試的全層皮膚)的制備方法模擬了人體皮膚的生長發(fā)育過程，制備周期短，方法簡易，可控性強，并且構(gòu)建全程不使用外源支架材料，通過細胞自分泌細胞外基質(zhì)形成皮膚支架，維持皮膚各層細胞生長的微環(huán)境，制備所得的含脂肪層全層皮膚更接近于正常人體皮膚結(jié)構(gòu)，并具備相應(yīng)的功能性，在體外條件下其功能和活性維持時間長，能夠滿足相關(guān)皮膚生物學(xué)檢測的需求，可用于皮膚相關(guān)的體外替代試驗。
[0016]以下結(jié)合實例對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步的詳細說明。
[0017]【附圖說明】:
圖1是含脂肪層全層皮膚的脂肪層光鏡下脂肪細胞形成的脂滴圖。
[0018]圖2是脂肪層組織學(xué)圖。
[0019]圖3是含脂肪層全層皮膚構(gòu)建完成后的組織學(xué)圖。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
步驟一、脂肪層的構(gòu)建
1、P3代的脂肪間充質(zhì)干細胞消化后，于800rpm/min條件下離心8min。在含體積比為10%胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，每孔0.25Ε6密度接種至Transwell小室，保持小室內(nèi)液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培養(yǎng)；
2、24h后更換培養(yǎng)液:棄去小室內(nèi)外的a-MEM培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培養(yǎng)5d，每隔2d換液；
3、5d(天的英文day的簡寫)后，重復(fù)步驟l，24h后更換小室內(nèi)外培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150 μ 1，5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)2d，每隔24h更換小室內(nèi)液體，加液量同上。成脂誘導(dǎo)液組成:a -MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，其中添加體積比分別為5?10%的胎牛血清(FBS)，Π引噪美辛 0.03mg/ml，IBMX 0.lmg/ml，胰島素 0.01 mg/ml，地塞米松 0.7 μ g/ml。
[0021]