一種縊蟶活性十肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物活性肽領(lǐng)域，尤其涉及一種縊蟶活性十肽及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋貝類資源豐富且富含許多生理活性物質(zhì)，因而逐漸被廣泛研究和應(yīng)用?？O 経（Sinonovaculaconstricta)俗名経子，屬瓣鮑綱、異齒亞綱、簾蛤目、燈塔蛤科、溢経 屬，在我國沿海均有分布，產(chǎn)量較大，為我國四大養(yǎng)殖貝類之一[安賢惠，李聯(lián)泰?？O蟶研 究現(xiàn)狀及發(fā)展前景.科學(xué)養(yǎng)魚，2005(1) :4-6.]，縊蟶肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，富含人體生命 活動(dòng)所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[李太武，林葉，蘇秀榕，不同群 體溢経營養(yǎng)成分的多元性分析，食品科學(xué)，2008,29(11) :548-551 ;Remacha，TrivinoA， Anadon.ReproductivecycleoftherazorclamSolenmarginatus(Pulteney1799) inSpain：acomparativestudyinthreedifferentlocations，Journalofshellfish research，2006, 25 (3) :869-876 ;安賢惠，幾種縊蟶的營養(yǎng)性和健康性分析評(píng)價(jià)，海洋湖沼 通報(bào)，2005(4) :99-103;李太武，林葉，蘇秀榕，不同群體縊蟶營養(yǎng)成分的多元性分析[J]， 食品科學(xué)，2008, 29 (11) :548-551 ;林葉，蘇秀榕，孫蓓等，不同種群縊蟶氨基酸及脂肪酸比 較研究，食品科學(xué)，2006, 27 (12) :675-678]。
[0003] 縊蟶性寒、可補(bǔ)陰去邪熱，治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產(chǎn)后虛損、虛熱等癥，具有較高 的藥用食用價(jià)值[蔣忠妙，鄭國平，陳木森.舟山群島海洋藥用動(dòng)物資源及民間應(yīng)用的調(diào) 查[刀.中國海洋藥物，2002,85(1):35.;蘇晶，蘇明翥編著，水產(chǎn)品藥用巧治百病.沈陽： 遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2000,187.];縊蟶的活性成分還具有較高的研究價(jià)值，如雷曉凌等 [雷曉凌，吳紅棉，范秀萍等，縊蟶糖胺聚糖的提取分離及其體外抗腫瘤活性的初步研究， 藥物生物技術(shù)，2004,11 (3) :146-149]，對縊蟶肉的酶解條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)提取得到的糖 胺聚糖對體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞均有一定抑制作用，且隨著用量增加抑制作用增強(qiáng)。張永 娟等[張永娟，鄭惠珍，縊蟶多肽的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用，時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22(5): 1076-1077]，提取縊蟶多肽能促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟發(fā)育及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，提高小 鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD還能提高血清S0D、GSH-Px水平，降低血清MDA含量。
[0004] 活性肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物，在人體內(nèi)起重要生理 作用，發(fā)揮生理功能，如：調(diào)節(jié)體內(nèi)的水分、電解質(zhì)平衡；促進(jìn)傷口愈合；修復(fù)細(xì)胞、改善細(xì) 胞代謝，能起到防癌作用等。活性肽一般通過酶解生物活性材料獲得，鄭惠娜等發(fā)現(xiàn)食物蛋 白通過蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽（《海洋蛋白酶解制備生物活性肽的 研究進(jìn)展》，鄭惠娜、章超樺、曹文紅，水產(chǎn)科學(xué)，2008, 27 (7)，370)。對于縊蟶，在抗腫瘤方面 的研究還很少，特別是利用酶解技術(shù)提取多肽在抗腫瘤方面的研究并未見報(bào)道。因此對縊 蟶酶解多肽進(jìn)行研究，對進(jìn)一步研究和開發(fā)以縊蟶酶解多肽多基礎(chǔ)的功能性食品和藥物， 提高縊蟶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種具有抗腫瘤活性 的縊蟶活性十肽。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述縊蟶活性十 肽的制備方法。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種上述縊蟶活性十 肽的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明解決上述第一個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：該縊蟶活性十肽，其特征 在于該氨基酸序列為：Ile-Asp-Gly-His-Ala_Ala-Gly-Asp-Val-Gly。
[0009]進(jìn)一步地，所述十肽的HR-ESI-MS檢測的分子離子峰為m/z835. 7Da[M+H]+。
[0010] 本發(fā)明解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：包括以下步驟：
[0011] (1)新鮮縊蟶去殼取肉，縊蟶肉洗凈后搗碎，按料液比1:1~3加水進(jìn)行組織勻漿， 勻漿后調(diào)節(jié)勻漿液pH值為2~3. 5備用；
[0012] (2)在上述勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，獲取酶解樣品，酶解溫度為30~ 45°C，加酶量為300~1200U/g縊蟶肉，酶解時(shí)間為2~8h，酶解完成后于30~45°C、2~ 8h進(jìn)行滅酶；
[0013] (3)將上述酶解樣品過5KD、8KD超濾膜進(jìn)行超濾，分別收集分子量大于8KD、分子 量為8~5KD以及分子量小于5KD的酶解液組進(jìn)行冷凍干燥；
[0014] (4)將步驟（3)中的各分子量段的酶解液組分別通過MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性檢測， 取抗腫瘤活性最高的酶解液組進(jìn)行G-25凝膠分離，收集相應(yīng)的洗脫峰；
[0015] (5)對步驟（4)中收集的洗脫峰進(jìn)行反相高效液相色譜純化，收集各峰組分并進(jìn) 行氨基酸測序，獲得所述縊蟶活性十肽。
[0016] 作為優(yōu)選：縊蟶活性十肽的制備方法為：（1)新鮮縊蟶去殼取肉，洗凈后搗碎，按 料液比1:1加水進(jìn)行組織勻漿，勻漿后調(diào)節(jié)勻漿液PH值為3備用；
[0017] (2)在上述勻漿液中加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，獲得酶解樣品，酶解溫度為45°C，加 酶量為300U/g縊蟶肉，酶解時(shí)間為8h，酶解完成后于30~45°C、2~8h進(jìn)行滅酶；
[0018] (3)將上述酶解樣品過5KD超濾膜進(jìn)行超濾，收集分子量小于5KD的酶解液進(jìn)行冷 凍干燥；
[0019] (4)對步驟（3)中收集的酶解液進(jìn)行G-25凝膠分離，收集洗脫峰5;
[0020] (5)對步驟（4)中收集的洗脫峰5進(jìn)行反相高效液相色譜純化，收集各峰組分并進(jìn) 行氨基酸測序，獲得所述縊蟶活性十肽。
[0021] 前述反相高效液相色譜條件為：ZorbaxSB-C18色譜柱4. 6X250mm5um，檢測波 長280nm/214nm，柱溫為20°C，進(jìn)樣量為100ul，梯度洗脫，流速為I.Oml/min，流動(dòng)相A為 0? 06%TFA，B為0? 05%TFA的乙腈，洗脫程序：0%~0%B洗脫4分鐘，0%~7%B洗脫 25分鐘，7 %~100 %B洗脫1分鐘，100 %~100 %B洗脫5分鐘。
[0022] 本發(fā)明解決上述第三個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種上述縊蟶活性十肽在 制備抗腫瘤藥物和食品中的應(yīng)用。
[0023] 進(jìn)一步地，所述抗腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，所述腫瘤為人前列腺癌。
[0024] 再進(jìn)一步地，所述縊蟶活性十肽對人前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖抑制率與濃度和 作用時(shí)間呈依賴關(guān)系。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種全新的縊蟶活性十肽， 能較好地抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖活性，對人前列腺癌PC-3細(xì)胞的最大增殖抑制率可高 于90%，體外抗前列腺癌效果顯著，可為抗前列腺癌藥物的研究提供理論基礎(chǔ)，該縊蟶活性 十肽通過生物酶解方式獲得，原料來源廣泛，成本低，采用胃蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解方式溫 和，酶解產(chǎn)品貼合人體自然需要，對進(jìn)一步研究和開發(fā)以縊蟶為基礎(chǔ)的藥物、提供縊蟶的經(jīng) 濟(jì)價(jià)值具有重大意義。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中分子量小于5KD的酶解液樣品的G-25分離純化圖；
[0027]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1峰5樣品的反相高效液相色譜圖；
[0028] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中縊蟶活性十肽的質(zhì)譜（ESI/MS)圖；
[0029] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中縊蟶活性十肽對PC-3細(xì)胞增殖活性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0031] 實(shí)施例1:溢蟶活性十肽的制備
[0032] 1、前處理：
[0033] 取新鮮縊蟶，去殼取縊蟶肉，洗凈后瀝干備用。
[0034] 2、胃蛋白酶解
[0035] 2. 1用高速組織搗碎機(jī)將縊蟶肉搗碎，加入蒸餾水勻漿，料液比1:1~3,精密稱取 勻漿液，用〇?lmol/L的鹽酸溶液和0?lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)勻漿液pH值，加入胃蛋白 酶酶解數(shù)小時(shí)，酶解條件為：酶解溫度30~45°C，pH為2~3. 5,酶解時(shí)間2~8h，加酶量 300~1200U/g溢経肉。酶解結(jié)束后于100°C下滅酶15min，4°C下離心15min(10000r/min)， 取上清液備用。
[0036] 2. 2胃蛋白酶解工藝優(yōu)化
[0037]2. 2. 1選用堿性蛋白酶，以A(溫度）、B(pH)、C(加酶量）、D(料液比）和E(時(shí)間）5 個(gè)因素，選4個(gè)水平進(jìn)行L16(45)的正交實(shí)驗(yàn)，通過MTT法篩選在不同酶解條件下的酶解液 對前列腺癌細(xì)胞增殖抑制率最高的酶解條件，從而確定最佳水解條件，并進(jìn)行大量酶解。胃 蛋白酶因素和水平如表1所示：
[0038]表1胃蛋白酶的因素與水平
[0039]
[0040]2. 2. 2本實(shí)施例中選取前列腺癌細(xì)胞PC-3激素非依賴型細(xì)胞（原購自中科院上海 細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存），細(xì)胞培養(yǎng)過程如下：
[0041] (I)、細(xì)胞復(fù)蘇
[0042] 從液氮罐中取出存放的PC-3細(xì)胞株，快速的放入37 °C恒溫水浴鍋中進(jìn)行融化，待 融化后進(jìn)入無菌工作室進(jìn)行操作，用滅菌好的吸管將細(xì)胞株吸入離心管，加入2mL的F12營 養(yǎng)液，1000 rpm離心lOmin，去上清液，加入4ml的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打使細(xì)胞成為單個(gè)細(xì)胞。 然后用吸管將細(xì)胞均勻的吸入到2個(gè)25mL的培養(yǎng)瓶中，放入5%C02、37°C的恒溫培養(yǎng)箱培 養(yǎng)，次日換液倒掉未貼壁的死亡細(xì)胞。
[0043] (2)、細(xì)胞培養(yǎng)
[0044] 將人前列腺癌細(xì)胞PC-3接種到分別含有10 %胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)）FBS和雙抗 (青霉素G100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的F12和1640營養(yǎng)液中，放置于37°C、5% 0)2的恒 溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每1天換液一次，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80%左右時(shí)進(jìn)行傳 代。按照1 : 2的比例進(jìn)行傳代，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0045] (3)、細(xì)胞傳代
[0046] 先將長滿細(xì)胞的培