一種縊蟶活性四肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物活性肽領域，尤其涉及一種縊蟶活性四肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 溢蟶（Sinonovacula constricta)俗名蟶子，屬瓣觸綱、異齒亞綱、簾蛤目、燈塔蛤 科、縊蟶屬，在我國沿海均有分布，產量較大，為我國四大養(yǎng)殖貝類之一?？O蟶肉味鮮美、性 寒、營養(yǎng)豐富，富含人體生命活動所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質可補陰 去邪熱，治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產后虛損、虛熱等癥，具有較高的藥用食用價值。
[0003] 活性肽是由兩個或兩個以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物，在人體內起重要生理 作用，發(fā)揮生理功能，如：調節(jié)體內的水分、電解質平衡；促進傷口愈合；修復細胞、改善細 胞代謝，能起到防癌作用等?；钚噪囊话阃ㄟ^酶解生物活性材料獲得，鄭惠娜等發(fā)現(xiàn)食物蛋 白通過蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽（《海洋蛋白酶解制備生物活性肽 的研究進展》，鄭惠娜、章超樺、曹文紅，水產科學，2008, 27 (7)，370)。在對縊蟶肉的蛋白酶 解產物研究方面，雷曉凌等對縊蟶肉的酶解條件進行研究，發(fā)現(xiàn)提取得到的糖胺聚糖對體 外培養(yǎng)的HL-60細胞均有一定抑制作用，且隨著用量增加抑制作用增強（《縊蟶糖胺聚糖 的提取分離及其體外抗腫瘤活性的初步研究》，雷曉凌、吳紅棉、范秀萍等，藥物生物技術， 2004, 11 (3) :146-149);張永娟等研究發(fā)現(xiàn)提取的縊蟶多肽能促進小鼠胸腺和脾臟發(fā)育及 遲發(fā)型變態(tài)反應的發(fā)生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平（《縊蟶多肽的免疫調節(jié)及 抗氧化作用》，張永娟、鄭惠娜，時珍國醫(yī)國藥，2011，22 (5) :1076-1077)。然而，上述研究一 般僅涉及縊蟶蛋白酶解多肽混合物的研究，對具體的功能性多肽單體未進一步進行研究， 本申請通過提取縊蟶活性四肽，對縊蟶的抗腫瘤活性進行進一步研究。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種縊蟶活性四肽。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種上述縊蟶活性四 肽的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種上述縊蟶活性四 肽的應用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種縊蟶活性四肽，其氨基酸系 列為：Leu-Pro-Gly-Pro。
[0008] -種如權利要求1所述的縊蟶活性四肽的制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)新鮮縊蟶去殼取肉，洗凈后搗碎，按料液比1:1~3加水進行組織勻漿，勻漿后 調節(jié)勻漿液pH值為2~3. 5備用；
[0010] (2)在上述勻漿液中加入胃蛋白酶進行酶解，獲取酶解樣品，酶解溫度為30~ 45°C，加酶量為300~1200U/g縊蟶肉，酶解時間為2~8h，酶解完成后于95~100°C、10~ 15min進行滅酶；
[0011] (3)將上述酶解樣品過5KD、8KD超濾膜進行超濾，分別收集分子量大于8KD、分子 量為8~5KD以及分子量小于5KD的酶解液組進行冷凍干燥；
[0012] (4)對步驟（3)中收集各分子量段的酶解液分別進行反相高效液相色譜純化，收 集各峰組分并進行氨基酸測序，獲得所述縊蟶活性四肽。
[0013] 作為優(yōu)選，縊蟶活性四肽的制備方法為：（1)新鮮縊蟶去殼取肉，洗凈后搗碎，按 料液比1:1加水進行組織勻漿，勻漿后調節(jié)勻漿液pH值為3備用；
[0014] (2)在上述勻漿液中加入胃蛋白酶進行酶解，獲得酶解樣品，酶解溫度為45°C，加 酶量為300U/g縊蟶肉，酶解時間為8h，酶解完成后于95~100°C、10~15min進行滅酶；
[0015] (3)將上述酶解樣品過5KD超濾膜進行超濾，收集分子量小于5KD的酶解液進行冷 凍干燥；
[0016] (4)對步驟（3)中收集的酶解液進行反相高效液相色譜純化，收集各峰組分并進 行氨基酸測序，獲得所述縊蟶活性四肽；
[0017] 前述反相高效液相色譜條件為：Agilent C18色譜柱4.6 X 250mm 5um，檢測波長 280nm，柱溫為20°C，進樣量為100ul，梯度洗脫，流速為1.0ml/min，流動相A為0. 06% TFA， B為0. 05 % TFA的乙腈，洗脫程序：0 %~1 % B洗脫4分鐘，0 %~7 % B洗脫25分鐘，7 %~ 100% B洗脫1分鐘，100 %~100% B洗脫5分鐘。
[0018] -種上述縊蟶活性四肽在抗腫瘤藥物中的應用。
[0019] 所述抗腫瘤為抑制腫瘤細胞的增殖活性，所述腫瘤為人前列腺癌。
[0020] 進一步，所述縊蟶活性四肽對人前列腺癌PC-3細胞的增殖抑制率與濃度和作用 時間呈正相關，當濃度為5~15mg/ml，作用時間為24~72h時，增殖抑制率為39. 75~ 99. 55%〇
[0021] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供了一種全新的縊蟶活性四肽， 能較好地抑制人前列腺癌細胞增殖活性，對人前列腺癌PC-3細胞的最大增殖抑制率可達 98. 94%，體外抗前列腺癌效果顯著，可為抗前列腺癌藥物的研究提供理論基礎。該縊蟶活 性四肽通過生物酶解方式獲得，原料來源廣泛，成本低，同時模擬人體內部消化環(huán)境，采用 胃蛋白酶進行酶解，酶解方式溫和，酶解產品貼合人體自然需要，對進一步研究和開發(fā)以縊 蟶為基礎的藥物、提供縊蟶的經濟價值具有重大意義。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實施例1中分子量小于5KD的酶解液反相高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0024] 實施例1 :溢蟶活性四肽的制備
[0025] 1、前處理：
[0026] 取新鮮縊蟶，去殼取縊蟶肉，洗凈后浙干備用。
[0027] 2、胃蛋白酶解
[0028] 2. 1用高速組織搗碎機將縊蟶肉搗碎，加入蒸餾水勻漿，料液比1:1~3,精密稱取 勻漿液，用〇· lmol/L的鹽酸溶液和0· lmol/L的NaOH溶液調節(jié)勻漿液pH值，加入胃蛋白 酶酶解數(shù)小時，酶解條件為：酶解溫度30~45°C，pH為2~3. 5,酶解時間2~8h，加酶量 300~1200U/g溢蟶肉。酶解結束后于10CTC下滅酶15min，4°C下離心15min(10000r/min)， 取上清液備用。
[0029] 2. 2胃蛋白酶解工藝優(yōu)化
[0030] 2.2. 1、選用胃蛋白酶，以A(溫度）、B(pH)、C(加酶量）、D(料液比）和E(時間）5 個因素，選4個水平進行L16(45)的正交實驗，通過MTT法篩選在不同酶解條件下的酶解液 的對前列腺癌細胞PC-3增殖抑制率最高的酶解條件，從而確定最佳水解條件，并進行大量 酶解。胃蛋白酶因素和水平如表1所示：
[0031] 表1胃蛋白酶的因素與水平
[0033] 2. 2. 2本實施例中選取前列腺癌細胞PC-3激素非依賴型細胞（原購自中科院上海 細胞庫，由本實驗室傳代保存），細胞培養(yǎng)過程如下：
[0034] (1)、細胞復蘇
[0035] 從液氮罐中取出存放的PC-3細胞株，快速的放入37 °C恒溫水浴鍋中進行融化，待 融化后進入無菌工作室進行操作，用滅菌好的吸管將細胞株吸入離心管，加入2mL的F12營 養(yǎng)液或RPMI1640營養(yǎng)液，lOOOrpm離心10min，去上清液，加入4ml的營養(yǎng)液，反復吹打使 細胞成為單個細胞。然后用吸管將細胞均勻的吸入到2個25mL的培養(yǎng)瓶中，放入5% C02、 37°C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液倒掉未貼壁的死亡細胞。
[0036] (2)、細胞培養(yǎng)
[0037] 將人前列腺癌細胞PC-3接種到分別含有10 %胎牛血清（體積分數(shù)）FBS和雙抗 (青霉素 G100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的F12和1640營養(yǎng)液中，放置于37°C、5% C02的恒 溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長，每1天換液一次，待細胞長滿培養(yǎng)瓶的80%左右時進行傳 代。按照1 : 2的比例進行傳代，收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。
[0038] (3)、細胞傳代
[0039] 先將長滿細胞的培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出放到無菌操作臺上。傳代時，先倒掉 瓶中的營養(yǎng)液，去除不貼壁生長的死細胞，用〇. 25%胰蛋白酶/0. 02% EDTA消化液混合消 化，不同細胞消化的時間不同，一般消化時間為3-5min ;顯微鏡下觀察細胞，當細胞間隙明 顯變大且細胞變圓變亮時，說明細胞已經消化完畢，去掉消化酶液。在培養(yǎng)瓶中加入2. 5mL 左右的營養(yǎng)液，反復吹打消化好的貼壁細胞使之成為單個細胞，一般情況下一瓶細胞傳2 瓶，將傳代好的細胞置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
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