有機(jī)碳生物活性的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種有機(jī)碳生物活性的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋占地球表面積71%，已知人類(lèi)活動(dòng)產(chǎn)生的二氧化碳大約有1/3被海洋吸收，海洋碳循環(huán)對(duì)全球氣候變化影響重大。
[0003]海洋中的有機(jī)碳主要是以溶解有機(jī)碳的形式存在的。溶解有機(jī)碳中約有95%是生物難以利用的惰性有機(jī)碳(Eichinger et al., 2006 ；Hansell et al.，2009)，可在海洋中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)數(shù)千年，其總量可與大氣二氧化碳的總碳量相媲美，構(gòu)成了海洋儲(chǔ)碳。
[0004]海洋微型生物是海洋惰性有機(jī)碳主要來(lái)源，微型生物將活性有機(jī)碳轉(zhuǎn)化為惰性有機(jī)碳，長(zhǎng)期儲(chǔ)存于海洋中(Jiao et al.，2010)。此生物過(guò)程對(duì)于應(yīng)對(duì)全球變暖具有極其重要的意義。溶解有機(jī)碳的生物活性的鑒定對(duì)于評(píng)估有機(jī)碳在海洋儲(chǔ)碳庫(kù)中的作用具有重要意義。對(duì)于我們?nèi)胬斫夂Ｑ笤谌驓夂蜃兓淖饔靡饬x重大。
[0005]然而，對(duì)于有機(jī)碳的生物活性卻長(zhǎng)期以來(lái)缺乏定量分析的方法，極大地制約了人們對(duì)海洋碳庫(kù)及海洋儲(chǔ)碳的過(guò)程與機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種可實(shí)時(shí)定量分析有機(jī)碳對(duì)海洋細(xì)菌生物活性的有機(jī)碳生物活性的分析方法。
[0007]本發(fā)明包括以下步驟:
[0008]I)將有機(jī)碳配制成水溶液，得有機(jī)碳儲(chǔ)備液；
[0009]2)將步驟I)得到有機(jī)碳儲(chǔ)備液過(guò)濾滅菌。
[0010]3)將待分析的細(xì)菌接種到培養(yǎng)基Ml中進(jìn)行前培養(yǎng)，使得菌體濁度達(dá)到0D600=1，將菌液離心，去上清，收集菌體，在菌體中加入NaCl，懸濁后再次離心，最后將菌體用NaCl懸濁，得菌體前培養(yǎng)液；
[0011]4)將儲(chǔ)備液M2裝入培養(yǎng)瓶中，再加入滅菌蒸餾水、有機(jī)碳儲(chǔ)備液、菌體前培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶加蓋，放入微活性量熱儀中培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)過(guò)程中的熱量變化，進(jìn)行有機(jī)碳生物活性分析。
[0012]在步驟I)中，所述有機(jī)碳可采用天然有機(jī)碳或人工合成有機(jī)碳；所述天然有機(jī)碳可選自糖類(lèi)、氨基酸、有機(jī)酸等中的至少一種；所述有機(jī)碳儲(chǔ)備液的PH值可為7，配制終濃度為10倍濃度的有機(jī)碳儲(chǔ)備液。
[0013]在步驟2)中，所述過(guò)濾滅菌可用0.22 μπι已經(jīng)滅菌的微孔濾膜過(guò)濾滅菌。
[0014]在步驟3)中，所述培養(yǎng)基Ml的組成可為IL中含有Bacto Peptone, 1.0g ；yeast extract, 1.0g ;KC1，0.3g ；MgS04.7H20，0.5g ；CaCl2.2H20，0.038g ；NH4CI, 0.3g ;K2HPO4, 0.3g ；NaCl, 20.0g ; ImL微量元素溶液，pH 7.8 ;所述微量元素溶液IL中含有FeSO4.7Η20，2.Ig ;H3B03，30mg ；MnCl2.4Η20，0.Ig ；CoCl2.6Η20，0.19g ；CuCl2.6H20，2mg ；ZnSO4.7Η20，0.144g ；Na2MoO4.2H20，36mg ;
[0015]所述離心的條件可為8000g離心5min ;所述在菌體中加入NaCl可在菌體中加入與菌液等量的質(zhì)量百分濃度為0.8%的NaCl ;所述再離心的條件可為8000g再離心5min ;所述最后將菌體用NaCl懸濁可將菌體用與菌液等量的質(zhì)量百分濃度為0.8%的NaCl懸濁。
[0016]在步驟4)中，所述儲(chǔ)備液M2的成分為IL中含有KCl, 0.6g ;MgS04.7H20, 1.0g ;CaCl2.2H20, 0.076g ；NH4Cl, 0.6g ；K2HPO4, 0.6g ；NaCl, 40.0g ；2mL 微量元素溶液，pH 7.8 ;所述微量元素溶液 IL 中含有 FeSO4.7Η20，2.Ig ；H3BO3, 30mg ；MnCl2.4Η20，0.Ig ；CoCl2.6Η20，0.19g ；CuCl2.6H20，2mg ；ZnSO4.7H20，0.144g ；Na2MoO4.2H20，36mg，pH 7.8 ;所述儲(chǔ)備液 M2、滅菌蒸餾水、有機(jī)碳儲(chǔ)備液、菌體前培養(yǎng)液的體積比可為1: 0.6: 0.2: 0.2，培養(yǎng)瓶的容積為4ml，最終培養(yǎng)體系為2ml。
[0017]所述培養(yǎng)基Ml的成分無(wú)限制，可以根據(jù)細(xì)菌的不同而不同。培養(yǎng)基Ml為細(xì)菌最適培養(yǎng)基或菌保中心提供的用于特定細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基；儲(chǔ)備液M2是將培養(yǎng)基Ml中的有機(jī)碳去除的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基僅含有無(wú)機(jī)鹽及微量元素。儲(chǔ)備液M2需要配制成2倍的儲(chǔ)備液，將配制好的培養(yǎng)基Ml和儲(chǔ)備液M2經(jīng)120度高壓滅菌20min備用。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所提供的有機(jī)碳的生物活性的分析方法靈敏度高，對(duì)微生物培養(yǎng)過(guò)程的能量變化可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，容易操作，重復(fù)性好，精確度高。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1氨基酸生物活性的分析結(jié)果。
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2糖、醇及有機(jī)酸的生物活性的分析結(jié)果。
[0021]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3糖及氨基酸生物活性的分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0023]本發(fā)明提供一種定量分析有機(jī)碳生物活性的方法，能夠?qū)崟r(shí)準(zhǔn)確地定量分析有機(jī)碳對(duì)純培養(yǎng)的微生物或環(huán)境微生物的活性。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明在分析海洋有機(jī)碳庫(kù)的性質(zhì)方面具有良好的應(yīng)用前景。
[0024]實(shí)施例1氨基酸生物活性的分析
[0025]1.1微活性量熱儀的準(zhǔn)備
[0026]微生物代謝活性的分析在微活性量熱儀中進(jìn)行。本實(shí)施例將溫度設(shè)定為28°C，穩(wěn)定儀器I?2h。
[0027]1.2有機(jī)碳儲(chǔ)備液的準(zhǔn)備
[0028]有機(jī)碳儲(chǔ)備液的配制:本實(shí)施例分析了有機(jī)碳L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-纈氨酸和D-纈氨酸的生物活性。有機(jī)碳儲(chǔ)備液的濃度均為10mM，pH調(diào)節(jié)為7.0。將此儲(chǔ)備液用0.22 μπι已經(jīng)滅菌的微孔濾膜過(guò)濾滅菌。
[0029]1.3細(xì)菌的前培養(yǎng)
[0030]本實(shí)施例采用的培養(yǎng)基Ml成分為IL含有Bacto Peptone, 1.0g ；yeastextract, 1.0g ;KC1，0.3g ；MgS04.7H20，0.5g ；CaCl2.2H20, 0.038g ;NH4C1，0.3g ;K2HPO4, 0.3g ;and NaCl, 20.0g ；lmL微量元素溶液，pH 7.8.微量元素溶液(L)的配方為:FeSO4.7Η20，2.Ig ;H3B03，30mg ；MnCl2.4Η20，0.Ig ；CoCl2.6Η20，0.19g ；CuCl2.6Η20，2mg ；ZnSO4.7Η20，0.144g ；Na2MoO4.2H20，36mg。
[0031]將配制好的培養(yǎng)基Ml，高壓滅菌120 °C 20min。將交替單胞菌Alteromonasmacleodii (ATCC27216)，接種到培養(yǎng)基Ml，28°C 180rpm，培養(yǎng)過(guò)夜。菌體濁度達(dá)到0D600 ^ I左右。將菌液在8000g離心5min，去上清，收集菌體。在菌體中加入等量的0.8% Nacl懸濁，同樣條件離心。此清洗過(guò)程重復(fù)兩次。最后將菌體用等量的0.8% Nacl懸濁。作為菌體前培養(yǎng)液待用。接種及菌體的清洗過(guò)程均在超凈臺(tái)進(jìn)行。
[0032]1.4細(xì)菌培養(yǎng)
[0033]儲(chǔ)備液M2 成分為 IL 含有 KCl, 0.6g ；MgS04.7H20, 1.0g ；CaCl2.2H20, 0.076g ；NH4Cl, 0.6g ；K2HP04, 0.6g ；and NaCl，40.0g ；2mL 微量元素溶液，pH 7.8.微量元素溶液(L)的配方為:FeSO4.7Η20，2.Ig ;H3B03，30mg ;MnCl2.4Η20，0.Ig ;CoCl2.6Η20，0.19g ;CuCl2.6H2O, 2mg ；ZnSO4.7H20，0.144g ；Na2Mo04.2H20，36mg，pH 7.8。
[0034]取1ml儲(chǔ)備液M2到4ml的培養(yǎng)瓶，加入0.6ml滅菌蒸餾水，0.2ml的有機(jī)碳儲(chǔ)備液，0.2ml菌體前培養(yǎng)液。最終培養(yǎng)體系為2ml。將培養(yǎng)瓶加蓋，壓緊。放入微活性量熱儀中培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)過(guò)程中的熱量變化。
[0035]1.5有機(jī)碳生物活性分析
[0036]反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中的熱量變化，進(jìn)行有機(jī)碳生物活性的分析。
[0037]由本實(shí)施例結(jié)果可見(jiàn)，所分析的有機(jī)碳中L-谷氨酸和L-纈氨酸對(duì)海洋細(xì)菌Alteromonas macleodii (ATCC27216)是具有活性的，D-谷氨酸和D-繳氨酸則不具有活性。其活性大小為L(zhǎng)-谷氨酸>L-纈氨酸>D-谷氨酸=D-纈氨酸。
[0038]本發(fā)明實(shí)施例1氨基酸生物活性的分析結(jié)果參見(jiàn)圖1。
[0039]實(shí)施例2糖、醇及有機(jī)酸的生物活性的分析
[0040]2.1微活性量熱儀的準(zhǔn)備
[0041]在將溫度設(shè)定到培養(yǎng)溫度28°C，穩(wěn)定儀器I?2h。
[0042]2.2有機(jī)碳儲(chǔ)備液的準(zhǔn)備
[0043]有機(jī)碳儲(chǔ)備液的配制:本實(shí)施例分析了葡萄糖、乙酸、甘油、葡糖胺對(duì)海洋細(xì)菌Dinoroseobacter shibae DFL12 (DSM16493)的生物活性。有機(jī)碳儲(chǔ)備液濃度為10%，pH調(diào)節(jié)為7.0。將此儲(chǔ)備液用0.22 μπι已經(jīng)滅菌的微孔濾膜過(guò)濾滅菌。
[0044]2.3細(xì)菌的前培養(yǎng)
[0045]本實(shí)施例采用培養(yǎng)基Ml成分為IL含有Bacto Peptone, 1.0g ；yeastextract, 1.0g ；NaCl 20g, KCl 0.3g,，MgSO4.7H20 0.5g, CaCl2.2H20 0.05g, NH4Cl0.3g, K2HPO40.3g,微量元素溶液lmL，pH 7.'.微量元素溶液(L)配方為:3.15gFeCl3.6H20, 4.36g Na2EDTA.2HZ0, 9.8mg CuSO4.5H20, 6.3