一種產生四氫嘧啶的基因工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物生物技術生產領域，尤其是一種產生四氫嘧啶的基因工程菌及 其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 目前四氫嘧啶的生產方法包括發(fā)酵法和酶催化法。其中，
[0003] 嗜鹽微生物中具有四氫嘧啶的合成途徑，因此廣泛應用于四氫嘧啶的發(fā)酵法生產 中。Sauer T等采用"細菌擠奶法"高密度發(fā)酵獲得了較高產量的四氫嘧啶，即高滲透壓下 培養(yǎng)細菌、然后低滲沖擊釋放溶質、再將菌體重新高滲培養(yǎng)、低滲沖擊釋放溶質，依次循環(huán) 多至8-9次，獲得產物。朱皖宜（201310416404. 4)等公開了一種可用于生產四氫嘧啶的新 的鹽單胞菌Halomonas sp. HS-2255及其突變株，保藏號為CGMCCNo. 6248。該菌株在含有可 同化的碳源和氮源且較低的NaCl含量的培養(yǎng)基中具有較高的四氫嘧啶產量，并且副產物 羥基四氫嘧啶的含量較低。
[0004] 酶催化法是通過在大腸桿菌中表達四氫嘧啶合成基因簇ectABC以獲得具有相 應酶活性的全細胞或粗酶液，以天冬氨酸為前體物催化合成四氫嘧啶的過程。董志揚 等（201310518176. 1,201310534045. 2)采用利用 E.coli BW-pBAD-ectABC，保藏編號為 CGMCCNO. 8334,將L-天冬氨酸鈉經生物轉化反應后即得。該菌體重復使用五次每升發(fā)酵菌 體共可以合成胞外四氫嘧啶87. 5g，合成效率達到11. 67g/L. d。
[0005] 以上兩種方法中，嗜鹽菌發(fā)酵生產四氫嘧啶的不足在于培養(yǎng)過程中均需要高的 NaCl濃度來刺激菌體積累更多的產物，發(fā)酵周期較長，而且高濃度的NaCl溶液對發(fā)酵設備 腐蝕嚴重，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產，同時高鹽的發(fā)酵廢液對環(huán)境造成了較大壓力；酶催 化法生產四氫嘧啶的底物為天冬氨酸鈉，酶需要誘導表達并提取，因此操作比較復雜，生產 成本較高。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種產生四氫嘧啶的基因工程菌。
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一技術問題在于提供上述產生四氫嘧啶的基因工程菌的構 建方法。
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一技術問題在于提供上述產生四氫嘧啶的基因工程菌的應 用，用于制備四氫嘧啶。
[0009] 為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：
[0010] 一種產生四氫嘧啶的基因工程菌（E. coliECT06)，為具有特定基因型的大腸桿菌， 包含來源于伸長鹽單胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三個基因缺陷型；具有Iac啟動子 控制的谷氨酸棒狀桿菌IysC基因；trc啟動子控制的ppc基因，其中，
[0011] 所述編碼基因 ectA的核苷酸序列為序列表400〈1>所示序列；
[0012] 所述編碼基因 ectB的核苷酸序列為序列表400〈2>所示序列；
[0013] 所述編碼基因 ectC的核苷酸序列為序列表400〈3>所示序列；
[0014] 所述編碼基因 thrA的核苷酸序列為序列表400〈4>所示序列；
[0015] 所述編碼基因 IysA的核苷酸序列為序列表400〈5>所示序列；
[0016] 所述編碼基因 IysC的核苷酸序列為序列表400〈6>所示序列；
[0017] 所述編碼基因 ppc的核苷酸序列為序列表400〈7>所示序列；
[0018] 所述編碼基因 iclR的核苷酸序列為序列表400〈8>所示序列。
[0019] 優(yōu)選的，上述產生四氫嘧啶的基因工程菌，是由下述方法構建得到的：
[0020] (1)以pTrc99a質粒為載體克隆伸長鹽單胞菌（CGMCC 1.6329)中的三個基因 ectABC到大腸桿菌E. coliW3110中，所述大腸桿菌保藏號ATCC 27325,構建出L-天冬氨 酸-β -半醛到四氫嘧啶的代謝途徑，所述三個基因 ectABC分別表達氨基丁酸乙酰基轉移 酶、二氨基丁酸氨基轉移酶和四氫嘧啶合成酶；
[0021] (2)敲除編碼高絲氨酸脫氫酶I和二氨基更二酸脫羧酶的基因 thrA和IysA ;在基 因組arsB位置整合由Iac啟動子控制的谷氨酸棒狀桿菌的天冬氨酸激酶基因 lysC，所述谷 氨酸棒狀桿菌保藏號ATCC 13032;
[0022] (3)將磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因 ppc的啟動子替換為trc啟動子，并敲除乙 醛酸循環(huán)控制基因 iclR以打開乙醛酸循環(huán)，最終獲得產生四氫嘧啶的基因工程菌，其中，
[0023] 所述編碼基因 arsB的核苷酸序列為序列表400〈9>所示序列。
[0024] -種產生四氫嘧啶的基因工程菌的構建方法（E. coli ECT06)，具體方法為：
[0025] (1)以 pTrc99a 質粒為載體克隆伸長鹽單胞菌 Halomonas elongateCGMCCL 6329 中的三個基因 ectABC到大腸桿菌E. coli W3110 (ATCC27325)中，構建出L-天冬氨 酸-β -半醛到四氫嘧啶的代謝途徑，所述三個基因 ectABC分別表達氨基丁酸乙?；D移 酶、二氨基丁酸氨基轉移酶和四氫嘧啶合成酶；
[0026] (2)敲除編碼高絲氨酸脫氫酶I和二氨基更二酸脫羧酶的基因 thrA和lysA，削 弱了 L-天冬氨酸-β-半醛到賴氨酸和蘇氨酸的代謝，但由于E.coli W3110中thrA基 因同時編碼天冬氨酸激酶，thrA的敲除會導致天冬氨酸到L-天冬氨酸-β -半醛的合成 受阻；在基因組arsB位置整合由Iac啟動子控制的谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicumATCC 13032的天冬氨酸激酶基因 lysC，保證了前體物L-天冬氨酸-β -半醛的 供應；
[0027] (3)將磷酸烯醇式丙酮酸激酶編碼基因 ppc的啟動子替換為trc啟動子，并敲除乙 醛酸循環(huán)控制基因 iclR以打開乙醛酸循環(huán)，增強了葡萄糖到L-天冬氨酸的代謝通量，最終 獲得產生四氫嘧啶的基因工程菌；其中，
[0028] 所述編碼基因 ectA的核苷酸序列為序列表400〈1>所示序列；
[0029] 所述編碼基因 ectB的核苷酸序列為序列表400〈2>所示序列；
[0030] 所述編碼基因 ectC的核苷酸序列為序列表400〈3>所示序列；
[0031] 所述編碼基因 thrA的核苷酸序列為序列表400〈4>所示序列；
[0032] 所述編碼基因 IysA的核苷酸序列為序列表400〈5>所示序列；
[0033] 所述編碼基因 IysC的核苷酸序列為序列表400〈6>所示序列；
[0034] 所述編碼基因 ppc的核苷酸序列為序列表400〈7>所示序列；
[0035] 所述編碼基因 iclR的核苷酸序列為序列表400〈8>所示序列；
[0036] 所述編碼基因 arsB的核苷酸序列為序列表400〈9>所示序列。
[0037] -種四氫嘧啶的制備方法，應用上述產生四氫嘧啶的基因工程菌（E.coli ECT06)，具體步驟如下：
[0038] (1)種子培養(yǎng)，將所述產生四氫嘧啶的基因工程菌經斜面活化后接種至裝有種子 培養(yǎng)基的500mL圓底三角瓶中，其中接種環(huán)每刮取一環(huán)使用種子培養(yǎng)基30mL，于35-39°C， 100-200rpm 搖床培養(yǎng) 6-8h ;
[0039] (2)發(fā)酵培養(yǎng)，以5-10%的接種量將步驟（1)的種子培養(yǎng)物接種至裝有30mL發(fā) 酵培養(yǎng)基的500mL擋板三角瓶中，35-39°C，150-250rpm進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過微量進樣器補 加氨水維持pH在6. 8-7. 2,補加 l-5mL，60 % (m/v)葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行，發(fā)酵周期 20-28h，即得。
[0040] 上述步驟⑵所得四氫嘧啶的產量可達到12-18g/L。
[0041] 上述四氫嘧啶的制備方法，所得發(fā)酵液中四氫嘧啶的檢測方法為：發(fā)酵液經 13000rpm高速離心2min后取上清，并用去離子水稀釋到一定濃度后使用高效液相色譜法 測定四氫嘧啶含量；檢測條件為：TSK-GEL C18色譜柱，流動相為2%乙腈溶液，柱溫30°C， 流速lmL/min，進樣量20 μ 1，紫外檢測波長210nm，保留時間5min。
[0042] 優(yōu)選的，上述四氫嘧啶的制備方法，所述種子培養(yǎng)基成分為：蔗糖20_40g， (NH 4)2SO4 l-5g，KH2PO4 l-5g，MgSO4 · 7H20 0· 2-2g，酵母粉 5-20g，玉米漿 0· 2-2mL， FeSO4 · 7H20 l-5mg，MnSO4 · H2O l-5mg，用去離子水定容到1L。上述培養(yǎng)基均可采用標準方 法制備獲得。
[0043] 優(yōu)選的，上述四氫嘧啶的制備方法，所述種子