一種靶向治療用人工趨磁細(xì)菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種靶向治療用人工細(xì)菌，特別是一種 靶向治療用人工趨磁細(xì)菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中存在大量能夠適應(yīng)并利用不同環(huán)境條件的微生物，可供我們開發(fā)利用。 其中一個(gè)特殊例子就是趨磁細(xì)菌。這類原核生物群體能夠借助地球磁場的作用，使自己迀 移至低氧海水環(huán)境中。雖然這類微生物在生理、形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)生上呈現(xiàn)多樣化的特性，但它 們依然表現(xiàn)出一些共同特性。趨磁細(xì)菌一般出現(xiàn)在海洋有氧層與無氧層的交界面附近，它 們幾乎都是厭氧或微耗氧細(xì)菌，或者兩種特性兼而有之。這一類群細(xì)菌的最顯著特征在于 它們能夠向著地球磁極運(yùn)動(dòng)。依靠自身鞭毛的作用，北半球的趨磁細(xì)菌向著北磁極運(yùn)動(dòng)，而 南半球的情況則相反。趨磁性與各種趨化性相配合，可以使趨磁細(xì)菌更好地適應(yīng)化學(xué)性質(zhì) 存在差異的不同水體底部的微氧環(huán)境。
[0003] 這種趨磁性由細(xì)菌內(nèi)部一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)一一磁小體介導(dǎo)。它由磷脂雙分子層包裹著 的磁鐵納米晶體組成，包含四氧化三鐵、四硫化三鐵、硫化亞鐵和八硫化七鐵等物質(zhì)。一般 情況下，磁小體的形態(tài)、晶體成分、尺寸和排列方式都有其種屬特異性。磁小體大小一般在 35到120納米之間，亦有報(bào)道指出在一些無法培養(yǎng)的菌株中存在250納米的磁小體。其形 狀包含矩形、長棱鏡狀和八面立方體等多種類型。各磁小體在細(xì)胞內(nèi)依次排列成一條或多 條長鏈，組成一個(gè)"磁場感應(yīng)器"，使趨磁細(xì)菌能夠順著外部磁場的方向游動(dòng)。磁小體的形 成機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為其形成應(yīng)當(dāng)包括以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：磁小體囊泡形成，攝入環(huán)境中的 鐵，向囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)鐵和晶體生物礦化。
[0004] 由于磁小體有包膜結(jié)構(gòu)、納米級(jí)大小、尺寸分布窄和具有鐵磁性等特點(diǎn)，自40年 前被發(fā)現(xiàn)以來，人們就對(duì)趨磁細(xì)菌及其磁小體進(jìn)行了多方面的研究與開發(fā)利用。曾有學(xué)者 利用趨磁細(xì)菌在隕石和巖石中尋找磁鐵礦。趨磁細(xì)菌也被用于清除污水中的放射性核素和 重金屬。雖然對(duì)趨磁細(xì)菌的研究不斷深入，但其苛刻的生長方式與復(fù)雜的營養(yǎng)要求，使得對(duì) 它的分離培養(yǎng)變得非常困難。因此僅有一小部分趨磁細(xì)菌能夠被培養(yǎng)與研究。由于對(duì)它們 缺乏了解，尚無一種能夠產(chǎn)生硫復(fù)鐵礦的趨磁細(xì)菌被純培養(yǎng)。這也阻礙了我們對(duì)天然趨磁 細(xì)菌應(yīng)用價(jià)值的開發(fā)。
[0005] 由于認(rèn)識(shí)水平與研究手段的原因，趨磁細(xì)菌的磁性內(nèi)含物反而得到了更廣泛的研 究利用，特別是在醫(yī)療與診斷領(lǐng)域，如磁共振成像、熱療、標(biāo)記細(xì)胞分離和藥物輸送等。利用 一些多功能分子對(duì)磁顆粒表面進(jìn)行修飾，可以將它的應(yīng)用范圍擴(kuò)展至生物技術(shù)領(lǐng)域。如利 用多基團(tuán)連接物的一端與磁顆粒外膜上的氨基酸等分子結(jié)合，另一端再與需要攜帶的藥物 分子結(jié)合，就可以將藥物固定在磁顆粒上。這一工程磁顆?？梢员皇┘拥拇艌霾东@，并將藥 物運(yùn)輸?shù)教囟ú课?。在DNA分離技術(shù)中，經(jīng)含氨基末端的有機(jī)物修飾的磁顆?？梢燥@著增 加 DNA回收效率。這種工程磁顆粒有望用于腫瘤治療中的藥物運(yùn)輸。腫瘤化療的一個(gè)主要 不足就是，毒性藥物經(jīng)過靜脈注射，隨著循環(huán)系統(tǒng)分布全身，無法被特異集聚在病灶部位。 由此帶來的副作用就是藥物攻擊腫瘤時(shí)，也會(huì)損傷正常的組織器官。而通過開發(fā)利用藥物 磁運(yùn)輸技術(shù)，可以明顯降低抗腫瘤藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)中的分布。同時(shí)由于藥物被靶向運(yùn) 輸至腫瘤部位，其治療效果可以得到明顯提高。這一結(jié)果在腦瘤和骨髓瘤等的動(dòng)物模型中 得到很好的驗(yàn)證。
[0006] 在這類研究中，藥物通常被連接到磁顆粒上，形成藥物載體復(fù)合物后經(jīng)靜脈注射 到動(dòng)物體內(nèi)。然后一個(gè)外加磁場被用于將藥物聚集在病灶部位。不過這些已有的靶向運(yùn)輸 都需要將一個(gè)永磁鐵盡可能地靠近目標(biāo)區(qū)域以提供靶向的外加磁場，直到釋放出磁顆粒。 這對(duì)于靠近身體表面的腫瘤具有良好的靶向效果，但對(duì)深部腫瘤其效果會(huì)明顯降低。同時(shí) 復(fù)雜的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)也會(huì)降低那些單純依靠體液運(yùn)輸?shù)乃幬锏陌邢蜻\(yùn)輸效果。這種靶向性 的降低也會(huì)帶來一定的治療副作用。并且通過化學(xué)修飾將藥物結(jié)合在磁顆粒的方法，對(duì)藥 物的種類和活性存在著明顯的限制作用，特別是一些生物活性藥物在修飾過程中容易被破 壞。實(shí)際上這類藥物一進(jìn)入人體就開始在各個(gè)部位發(fā)揮藥效，只是其藥效低于富集部位而 已。這類方案在時(shí)間和空間上，不易控制藥物活性的發(fā)揮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種能夠通過鞭毛自主運(yùn)動(dòng)并利用磁場將治療基因攜帶到靶向部位， 并在該部位進(jìn)行特異表達(dá)治療基因，以提高靶向治療效果的人工趨磁細(xì)菌及其構(gòu)建方法。 鑒于靶向治療與基因運(yùn)輸在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要作用，以及磁靶向運(yùn)輸技術(shù)在一些穩(wěn)定性 或水溶性較差藥物應(yīng)用方面的優(yōu)勢，本發(fā)明將對(duì)藥物與基因的靶向運(yùn)輸?shù)难芯颗c應(yīng)用具有 重要的補(bǔ)充和促進(jìn)作用。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種靶向治療用人工細(xì)菌，該細(xì)菌內(nèi)包含能 夠在細(xì)菌表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序列， 上述定位蛋白能夠通過生物親和作用與磁顆粒相連。
[0009] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述細(xì)菌選自能夠與生物體相容的非致病性細(xì)菌，優(yōu)選 大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸菌或枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述定位蛋白選自增強(qiáng)綠色熒光蛋白（eGFP)、黃色熒光 蛋白（YFP)、紅色熒光蛋白（RFP)或藍(lán)色熒光蛋白（BFP)，或者其它便于檢測的蛋白，優(yōu)選增 強(qiáng)綠色熒光蛋白（eGFP)。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述生物親和作用為生物素-親和素系統(tǒng)，具體是通過 生物素化的定位蛋白抗體介導(dǎo)上述定位蛋白與親和素標(biāo)記的納米磁顆粒相連。
[0012] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述治療基因選自侵襲因子、細(xì)胞溶解素、干擾素、細(xì)胞 因子或重組疫苗的基因。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種靶向治療用人工趨磁細(xì)菌，該細(xì)菌內(nèi)包 含能夠在細(xì)菌表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序 列，上述細(xì)菌表面表達(dá)有上述定位蛋白，上述定位蛋白通過生物親和作用與磁顆粒相連，形 成上述人工趨磁細(xì)菌。當(dāng)上述細(xì)菌與上述磁顆粒相連后，上述細(xì)菌能夠在外加磁場的作用 下富集到生物體內(nèi)的靶向部位，當(dāng)細(xì)菌的密度在上述靶向部位富集到上述密度感應(yīng)元件感 知的臨界密度時(shí)，上述密度感應(yīng)元件控制上述治療基因表達(dá)。
[0014] 本發(fā)明還提供一種人工趨磁細(xì)菌，該細(xì)菌內(nèi)包含能夠在大腸桿菌表面表達(dá)出增強(qiáng) 綠色熒光蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的黃色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)序列，上 述細(xì)菌表面表達(dá)有上述增強(qiáng)綠色熒光蛋白，上述增強(qiáng)綠色熒光蛋白通過生物素化的增強(qiáng)綠 色焚光蛋白的抗體與親和素標(biāo)記的納米磁顆粒相連，形成上述人工趨磁細(xì)菌。當(dāng)上述細(xì)菌 與上述納米磁顆粒相連后，上述細(xì)菌能夠在外加磁場的作用下富集到生物體內(nèi)的革El向部 位，當(dāng)上述細(xì)菌的密度在上述革E向部位富集到上述密度感應(yīng)元件感知的臨界密度時(shí)，上述 密度感應(yīng)元件控制上述黃色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)。
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述能夠在大腸桿菌表面表達(dá)出增強(qiáng)綠色熒光蛋白的基 因結(jié)構(gòu)是如SEQ ID N0:1所示的Pet23a sp-eGFP-aida質(zhì)粒；上述密度感應(yīng)元件控制的黃 色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)序列是如SEQ ID NO :2所示的JRI2YFP質(zhì)粒。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建靶向治療用人工細(xì)菌的方法，該方 法包括：將能夠在細(xì)菌表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因 表達(dá)序列導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)；其中上述定位蛋白能夠通過生物親和作用與磁顆粒相連。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建靶向治療用人工趨磁細(xì)菌的方法， 該方法包括：將能夠在細(xì)菌表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的治療 基因表達(dá)序列導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)；誘導(dǎo)上述定位蛋白表達(dá)，并將上述定位蛋白通過生物親和作用 與磁顆粒相連，形成上述人工趨磁細(xì)菌。當(dāng)上述細(xì)菌與上述磁顆粒相連后，上述細(xì)菌能夠在 外加磁場的作用下富集到生物體內(nèi)的革G向部位，當(dāng)上述細(xì)菌的密度在上述革El向部位富集到 上述密度感應(yīng)元件感知的臨界密度時(shí)，上述密度感應(yīng)元件控制上述治療基因表達(dá)。
[0018] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建人工趨磁細(xì)菌的方法，該方法包括：將能夠在大腸桿菌表 面表達(dá)出增強(qiáng)綠色熒光蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的黃色熒光蛋白報(bào)告基因 表達(dá)序列導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)；誘導(dǎo)上述增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)，并將上述增強(qiáng)綠色熒光蛋白通過 生物素化的增強(qiáng)綠色熒光蛋白的抗體與親和素標(biāo)記的納米磁顆粒相連，形成上述人工趨磁 細(xì)菌。當(dāng)上述細(xì)菌與上述納米磁顆粒相連后，上述細(xì)菌能夠在外加磁場的作用下富集到生 物體內(nèi)的革G向部位，當(dāng)上述細(xì)菌的密度在上述革El向部位富集到上述密度感應(yīng)元件感知的臨 界密度時(shí)，上述密度感應(yīng)元件控制上述黃色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)。
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