19] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述能夠在大腸桿菌表面表達出增強綠色熒光蛋白的基 因結(jié)構(gòu)是如SEQ ID NO :1所示的Pet23a sp-eGFP-aida質(zhì)粒；上述密度感應(yīng)元件控制的黃 色熒光蛋白報告基因表達序列是如SEQ ID NO :2所示的JRI2YFP質(zhì)粒。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供一種第一方面的人工細菌或第二方面的人工 趨磁細菌在制備靶向治療的藥物中的用途。
[0021] 本發(fā)明通過向細菌內(nèi)導(dǎo)入能夠在細菌表面表達出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度 感應(yīng)元件控制的治療基因表達序列，得到一種人工細菌，通過誘導(dǎo)定位蛋白表達，并將定位 蛋白通過生物親和作用與磁顆粒相連，得到一種人工趨磁細菌。該人工趨磁細菌能夠在外 加磁場的作用下富集到生物體內(nèi)的靶向部位，當細菌的密度在靶向部位富集到密度感應(yīng)元 件感知的臨界密度時，密度感應(yīng)元件控制治療基因表達，因此具有較好的靶向治療作用。本 發(fā)明的人工趨磁細菌可用于制備靶向治療的藥物中，提高治療的靶向性和特異性。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明一個實施例中的人工趨磁細菌及趨磁性示意圖；
[0023] 圖2是本發(fā)明一個實施例中的eGFP細菌頂端定位表達所需的基因結(jié)構(gòu)，即Pet23a sp-eGFP-aida質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024] 圖3是本發(fā)明一個實施例中的eGFP在細菌中的分布情況；
[0025] 圖4是本發(fā)明一個實施例中的eGFP在細菌表面的定位表達效果；
[0026] 圖5是本發(fā)明一個實施例中的納米磁顆粒在人工趨磁細菌上的標記效果；
[0027] 圖6是本發(fā)明一個實施例中的納米磁顆粒在人工趨磁細菌上的標記效果統(tǒng)計結(jié) 果；
[0028] 圖7是本發(fā)明一個實施例中的納米磁顆粒標記的細菌的靶向效果；
[0029] 圖8是本發(fā)明一個實施例中的報告基因 YFP在密度感應(yīng)元件控制下的基因結(jié)構(gòu)， 即JRI2YFP質(zhì)粒圖譜；
[0030] 圖9是本發(fā)明一個實施例中的YFP和plux的PCR擴增結(jié)果，其中泳道1是YFP片 段PCR產(chǎn)物，泳道2是plux片段PCR產(chǎn)物，泳道3是陰性PCR，泳道4是DNA marker ;
[0031] 圖10是本發(fā)明一個實施例中的pluxYFP的質(zhì)粒圖譜；
[0032] 圖11是本發(fā)明一個實施例中的pluxYFP的酶切鑒定結(jié)果，其中泳道1是pluxYFP 的Ndel/BamHI雙酶切得到的2200bps和750bps的兩條特異條帶，泳道2是DNA marker ;
[0033] 圖12是本發(fā)明一個實施例中的L-p IuxYFP酶切結(jié)果，其中泳道1是PCR產(chǎn)物 L-pluxYFP 經(jīng) XhoI/ApaLI 雙酶切的結(jié)果，泳道 2 是 DNA marker ;
[0034] 圖13是本發(fā)明一個實施例中的pluxRI2酶切結(jié)果，其中泳道1是pluxRI2經(jīng) XhoI/ApaLI雙酶切得到的2000bps的RI2片段和約1700bps的質(zhì)粒骨架片段，泳道2是DNA marker ；
[0035] 圖14是本發(fā)明一個實施例中的pluxYFPRI2的質(zhì)粒圖譜；
[0036] 圖15是本發(fā)明一個實施例中的pluxYFPRI2的酶切鑒定結(jié)果，其中泳道1是 pluxYFPRI2經(jīng)XhoI/ApaLI雙酶切得到的2000bps和2900bps的特異片段，泳道2是DNA marker ；
[0037] 圖16是本發(fā)明一個實施例中的pluxYFPRI2的酶切鑒定結(jié)果，其中泳道1是 pluxYFPRI2經(jīng)Xhol/Aatll雙酶切得到的約3800bps的RI2片段和約IIOObps的片段，泳道 2 是 DNA marker ;
[0038] 圖17是本發(fā)明一個實施例中的PCR產(chǎn)物p-YFP的酶切鑒定結(jié)果，其中泳道1是 p-YFP經(jīng)Xhol/Aatll雙酶切得到的結(jié)果，泳道2是DNAmarker ;
[0039] 圖18是本發(fā)明一個實施例中的JRI2YFP的酶切鑒定結(jié)果，其中泳道1是JRI2YFP 經(jīng)BamHI酶切得到的3000bps和1800bps的特異片段，泳道2是DNA marker ;
[0040] 圖19是本發(fā)明一個實施例中的JRI2YFP的YFP熒光的密度感應(yīng)效果。
【具體實施方式】
[0041] 下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0042] 鑒于天然趨磁細菌來源受限，培養(yǎng)困難。本發(fā)明提供一種能夠通過鞭毛自主運動 并利用磁場將治療基因攜帶到靶向部位，并在該部位進行特異表達治療基因，以提高靶向 治療效果的人工趨磁細菌及其構(gòu)建方法。鑒于靶向治療與基因運輸在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要 作用，以及磁靶向運輸技術(shù)在一些穩(wěn)定性或水溶性較差藥物應(yīng)用方面的優(yōu)勢，本發(fā)明將對 藥物與基因的靶向運輸?shù)难芯颗c應(yīng)用具有重要的補充和促進作用。
[0043] 本發(fā)明區(qū)分了靶向治療用的"人工細菌"和"人工趨磁細菌"兩個概念，前者是指， 細菌內(nèi)包含能夠在細菌表面表達出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的治療基 因表達序列，上述定位蛋白能夠通過生物親和作用與磁顆粒相連。也就是說，"人工細菌"具 有表達定位蛋白的潛能，或者在誘導(dǎo)條件下表達有定位蛋白，但是定位蛋白并沒有與磁顆 粒相連，在這種情況下，細菌還沒有獲得在外加磁場的作用下向生物體內(nèi)的靶向部位富集 的能力。后者是指，不但細菌內(nèi)包含能夠在細菌表面表達出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度 感應(yīng)元件控制的治療基因表達序列，而且定位蛋白已經(jīng)表達，并且定位蛋白通過生物親和 作用與磁顆粒相連，在這種情況下，細菌已經(jīng)獲得在外加磁場的作用下向生物體內(nèi)的靶向 部位富集的能力。本發(fā)明中，"人工趨磁細菌"可以看作是"人工細菌"與磁顆粒相連的結(jié) 果，其中磁顆粒可以看作已經(jīng)成為細菌的一部分結(jié)構(gòu)。
[0044] 需要說明的是，只需要向普通細菌中導(dǎo)入能夠在細菌表面表達出定位蛋白的基因 結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達序列，即可獲得本發(fā)明的人工細菌。而向普通 細菌中導(dǎo)入基因或表達序列的方法是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，并且確定能夠獲得攜帶相應(yīng)基因 或表達序列的重組細菌。因此，本發(fā)明的"人工細菌"具有可重復(fù)性的特征，本領(lǐng)域的技術(shù) 人員只要按照本發(fā)明提供的方法即可得到本發(fā)明的人工細菌。據(jù)此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng) 當理解，本發(fā)明無需提供菌種保藏也能滿足充分公開條件。
[0045] 本發(fā)明的一個實施方案中，磁顆粒選用納米級的磁顆粒，即納米磁顆粒，這種磁顆 粒比細菌的尺寸小，不會影響細菌的運動性。
[0046] 本發(fā)明的某些實施方案中，細菌可以選自能夠與生物體相容的非致病性細菌，優(yōu) 選大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸菌或枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌。
[0047] 本發(fā)明的某些實施方案中，定位蛋白可以選自增強綠色熒光蛋白（eGFP)、黃色熒 光蛋白（YFP)、紅色熒光蛋白（RFP)或藍色熒光蛋白（BFP)，或者其它便于檢測的蛋白，優(yōu)選 增強綠色熒光蛋白（eGFP)。這些蛋白具有便于檢測的優(yōu)勢，能夠精確、容易地定位其在細菌 表面上的位置，利于分析其與納米磁顆粒的共定位情況。
[0048] 本發(fā)明的一個實施方案中，生物親和作用為生物素-親和素系統(tǒng)，具體是通過生 物素化的定位蛋白抗體介導(dǎo)上述定位蛋白與親和素標記的納米磁顆粒相連。需要說明的 是，本發(fā)明中定位蛋白與納米磁顆粒的連接并不限于上述生物素-親和素系統(tǒng)，鑒于抗原 抗體反應(yīng)是生物學(xué)中常見且成熟的反應(yīng)模式，可以采用例如將定位蛋白的抗體直接包被在 納米磁顆粒上，再與細菌表面的定位蛋白結(jié)合的方式實現(xiàn)定位蛋白與納米磁顆粒的連接； 也可以先用定位蛋白的抗體結(jié)合細菌表面的定位蛋白，然后用連接有該抗體的抗體（即二 抗）的納米磁顆粒與細菌接觸，實現(xiàn)定位蛋白與納米磁顆粒的連接；等等。
[0049] 本發(fā)明的某些實施方案中，治療基因可以選自侵襲因子（Invasin)、細胞溶解素、 干擾素、細胞因子或重組疫苗的基因。需要說明的是，任何治療基因都可以通過本發(fā)明的人 工趨磁細菌富集到生物體的靶向部位，并在靶向部位經(jīng)密度感應(yīng)元件的調(diào)控實現(xiàn)治療基因 的特異性表達，從而實現(xiàn)治療目的。因此，本發(fā)明的人工細菌或人工趨磁細菌具有廣泛的靶 向治療作用，只要改變治療基因，即可實現(xiàn)治療作用的改變。也就是說，本發(fā)明具有普適性 的特點，因此本發(fā)明并不意圖限制治療基因的種類。
[0050] 需要說明的是，本發(fā)明雖然沒有特別針對某個治療基因進行具體的實驗研究，但 是本發(fā)明采用黃色熒光蛋白（YFP)作為報告基因成功驗證了本發(fā)明的可行性。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員公知，這樣的研究能夠可預(yù)期性地推廣到治療基因上，并且其效果也是可以預(yù)料到 的。
[0051] 以下通過實施例說明本發(fā)明的可行性，需要說明的是，以下實施例僅是示例性的，