12,參考 Chenli liu，2011)中擴增 約2200bps的plux片段。PCR結(jié)果如圖9所示。
[0102] 2)利用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI分別酶切步驟"1) "中的PCR產(chǎn)物YFP和plux。 利用T4連接酶對兩個酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞就可以得到如圖10所示 pluxYFP 克隆。
[0103] 3)抽提pluxYFP質(zhì)粒，并對pluxYFP進(jìn)行NdeI和BamHI酶切鑒定，可重新看到一 條750bps的條帶和一條2200bps的條帶，結(jié)果如圖11所示。
[0104] 8. 2 構(gòu)建 pluxYFPRI2
[0105] 1)利用引物L(fēng)-pluxYFP f?和L-pluxYFP r對質(zhì)粒pluxYFP進(jìn)行擴增，得到線性化 片段2900bps的L-pluxYFP。回收PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行XhoI和ApaLI雙酶切處理。PCR和酶 切結(jié)果如圖12。
[0106] 2)利用 XhoI 和 ApaLI 對質(zhì)粒 pluxRI2 (序列如 SEQ ID NO :13,參考 Chenli liu，2011)進(jìn)行雙酶切處理，得到約2000bps的RI片段。酶切結(jié)果如圖13所示。
[0107] 3)利用T4連接酶連接酶切處理的L-pluxYFP片段和RI片段。再轉(zhuǎn)化DH5a感受 態(tài)細(xì)胞可以得到如圖14所示pluxYFPRI2克隆（序列如SEQ ID NO :14)。
[0108] 4)抽提pluxYFPRI2質(zhì)粒，并進(jìn)行XhoI和ApaLI雙酶切鑒定，可以看到2900bps和 2000bps的條帶，結(jié)果如圖15所示。
[0109] 8.3構(gòu)建邛12丫卩卩
[0110] 構(gòu)建JRI2YFP的主要目的在于更改pluxYFPRI2中YFP的轉(zhuǎn)錄方向，避免YFP的轉(zhuǎn) 錄表達(dá)干擾LuxR基因的表達(dá)。
[0111] 1)對 pluxYFPRI2 進(jìn)行 AatII 和 XhoI 雙酶切，去除 YFP 基因，得到 3000bps 的 JRI2 片段。酶切結(jié)果如圖16所示。
[0112] 2)利用引物YFP - XhoI f?和YFP - AatII r對模板pIuxYFPRI2進(jìn)行擴增，得到約 1000 bps的p-YFP片段，5'端與3'端分別帶有XhoI與AatII酶切位點（在pluxYFPRI2中 剛好相反，這兩個酶切位點在YFP片段3'端與5'端）。對p-YFP片段進(jìn)行XhoI與AatII 雙酶切處理，PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果如圖17所示。
[0113] 3)利用T4連接酶連接酶切處理的JRI2片段和p-YFP片段，再轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì) 胞可以得到如圖8所示的JRI2YFP克隆。
[0114] 4)抽提JRI2YFP質(zhì)粒，并進(jìn)行BamHI酶切鑒定，可以看到1800bps和3000bps的 特異條帶。而BamHI酶切pluxYFPRI2得到的是1000和3800的條帶。酶切結(jié)果如圖18所 不。
[0115] 攜帶JRI2YFP的細(xì)菌含有密度感應(yīng)所需的基因原件luxR-luxI和被密度感應(yīng)原件 控制的報告基因 YFP，因此能對細(xì)菌自身的密度變化作出響應(yīng)。當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到閾值時，細(xì) 菌作出響應(yīng)，報告基因 YFP迅速表達(dá)。
[0116] 實施例9細(xì)菌密度感應(yīng)效果監(jiān)測
[0117] 將攜帶JRI2YFP的目的細(xì)菌（大腸桿菌）進(jìn)行30°C培養(yǎng)，利用多功能酶標(biāo)儀檢測 細(xì)菌不同生長階段的YFP黃色熒光水平，分析報告基因的密度感應(yīng)效果。如圖19所示，在 低密度時YFP報告基因不表達(dá)，基本沒有可檢測熒光信號，當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到1. 8附近，時YFP 基因感應(yīng)到密度變化。報告基因迅速表達(dá)，此時開始檢測到強熒光信號，顯示較好的密度感 應(yīng)效果（圖19中相對熒光指檢測到的熒光強度水平與0D600的比值）。
[0118] 用相應(yīng)的治療基因（如侵襲因子Invasin、細(xì)胞溶解素、干擾素、細(xì)胞因子和重組 疫苗等能夠在原核細(xì)菌中活性表達(dá)的基因）代替YFP報告基因，這一密度感應(yīng)原件系統(tǒng)即 可以導(dǎo)入到前面組裝的人工趨磁細(xì)菌中，得到具有靶向治療效果的人工趨磁細(xì)菌。
[0119] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā) 明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種靶向治療用人工細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌內(nèi)包含能夠在細(xì)菌表面表達(dá)出定 位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序列，所述定位蛋白能夠通過 生物親和作用與磁顆粒相連。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌選自能夠與生物體相容的 非致病性細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸菌或枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選大腸桿菌； 優(yōu)選地，所述定位蛋白選自增強綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或藍(lán)色熒 光蛋白，優(yōu)選增強綠色熒光蛋白； 優(yōu)選地，所述生物親和作用為生物素-親和素作用，具體是通過生物素化的定位蛋白 抗體介導(dǎo)所述定位蛋白與親和素標(biāo)記的納米磁顆粒相連； 優(yōu)選地，所述治療基因選自侵襲因子、細(xì)胞溶解素、干擾素、細(xì)胞因子或重組疫苗的基 因。3. -種靶向治療用人工趨磁細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌內(nèi)包含能夠在細(xì)菌表面表達(dá) 出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序列，所述細(xì)菌表面表達(dá) 有所述定位蛋白，所述定位蛋白通過生物親和作用與磁顆粒相連，形成所述人工趨磁細(xì)菌。4. 一種人工趨磁細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌內(nèi)包含能夠在大腸桿菌表面表達(dá)出增強 綠色熒光蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的黃色熒光蛋白報告基因表達(dá)序列，所 述細(xì)菌表面表達(dá)有所述增強綠色熒光蛋白，所述增強綠色熒光蛋白通過生物素化的增強綠 色熒光蛋白的抗體與親和素標(biāo)記的納米磁顆粒相連，形成所述人工趨磁細(xì)菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的人工趨磁細(xì)菌，其特征在于，所述能夠在大腸桿菌表面表達(dá) 出增強綠色熒光蛋白的基因結(jié)構(gòu)是如SEQ ID N0:1所示的Pet23a sp-eGFP-aida質(zhì)粒；所 述密度感應(yīng)元件控制的黃色熒光蛋白報告基因表達(dá)序列是如SEQ ID NO :2所示的JRI2YFP 質(zhì)粒。6. -種構(gòu)建靶向治療用人工細(xì)菌的方法，其特征在于，所述方法包括：將能夠在細(xì)菌 表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序列導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)； 其中所述定位蛋白能夠通過生物親和作用與磁顆粒相連。7. -種構(gòu)建靶向治療用人工趨磁細(xì)菌的方法，其特征在于，所述方法包括：將能夠在 細(xì)菌表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序列導(dǎo)入細(xì) 菌內(nèi)；誘導(dǎo)所述定位蛋白表達(dá)，并將所述定位蛋白通過生物親和作用與磁顆粒相連，形成所 述人工趨磁細(xì)菌。8. -種構(gòu)建人工趨磁細(xì)菌的方法，其特征在于，所述方法包括：將能夠在大腸桿菌表 面表達(dá)出增強綠色熒光蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及密度感應(yīng)元件控制的黃色熒光蛋白報告基因 表達(dá)序列導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)；誘導(dǎo)所述增強綠色熒光蛋白表達(dá)，并將所述增強綠色熒光蛋白通過 生物素化的增強綠色熒光蛋白的抗體與親和素標(biāo)記的納米磁顆粒相連，形成所述人工趨磁 細(xì)囷。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述能夠在大腸桿菌表面表達(dá)出增強綠 色熒光蛋白的基因結(jié)構(gòu)是如SEQ ID NO :1所示的Pet23a sp-eGFP-aida質(zhì)粒；所述密度感 應(yīng)元件控制的黃色熒光蛋白報告基因表達(dá)序列是如SEQ ID NO :2所示的JRI2YFP質(zhì)粒。10. -種權(quán)利要求1或2所述的人工細(xì)菌或權(quán)利要求3所述的人工趨磁細(xì)菌在制備靶 向治療的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向治療用人工趨磁細(xì)菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述人工趨磁細(xì)菌內(nèi)包含能夠在細(xì)菌表面表達(dá)出定位蛋白的基因結(jié)構(gòu)，以及密度感應(yīng)元件控制的治療基因表達(dá)序列，所述細(xì)菌表面表達(dá)有所述定位蛋白，所述定位蛋白通過生物親和作用與磁顆粒相連。本發(fā)明的人工趨磁細(xì)菌能夠在外加磁場的作用下富集到生物體內(nèi)的靶向部位，當(dāng)細(xì)菌的密度在靶向部位富集到密度感應(yīng)元件感知的臨界密度時，密度感應(yīng)元件控制治療基因表達(dá)，因此具有較好的靶向治療作用。本發(fā)明的人工趨磁細(xì)菌可用于制備靶向治療的藥物中，提高治療的靶向性和特異性。
【IPC分類】A61K41/00, C12N1/21, C12N15/70, C12R1/42, C12R1/225, C12R1/125, A61K47/46, C12R1/19
【公開號】CN105018401
【申請?zhí)枴緾N201510400517
【發(fā)明人】劉陳立, 賴旺生, 沈玥, 黃建東
【申請人】中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月9日