ng/ mL;奎尼酸溶液的濃度分別為：40 000ng/mL、20 000ng/mL、10 000ng/mL、5 000ng/mL、2 500ng/mL、I 250ng/mL和625ng/mL ;對照孔為50 μ L的樣品稀釋液。
[0089] 3、加抗體
[0090] 每孔加入50 μ L實施例1中的步驟五的2得到的抗綠原酸單克隆抗體溶液的稀 釋液（用樣品稀釋液稀釋成500ng/mL);每種稀釋液設(shè)置三個復(fù)孔；置濕盒中37°C條件下 30min，洗板4次。
[0091] 4、加酶標二抗
[0092] 將羊抗鼠酶標二抗IgG-HRP (0· lmg/mL，購自Jackson公司，商品目錄號為79556) 稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。
[0093] 5、顯色
[0094] 取20mg鄰苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀釋液中，加4 μ L 30% H2O2，將底物溶液 加入酶標板中，每孔100 μ L。避光顯色15min。
[0095] 6、終止
[0096] 每孔加入50 μ L終止液，用酶標儀492nm處測定各孔的OD值。
[0097] 以化合物溶液濃度為橫坐標，0D/0DJ0D值表示含有化合物時的吸光值，0D。表示 不含有化合物時的吸光值）為縱坐標，運用OriginPro 8軟件分別計算綠原酸、隱綠原酸、 新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、咖啡酸、奎尼酸、阿魏酸、肉桂酸和1，3-二 咖啡奎尼酸的IC 5。值，按下列公式計算交叉反應(yīng)率：交叉反應(yīng)率（％) = (IC5。（綠原酸）/ IC5。（綠原酸類似物））X 100 %。
[0098] 結(jié)果如表2所示：實施例1中的步驟五的2得到的抗綠原酸單克隆抗體對隱綠原 酸的交叉反應(yīng)率為1. 926% ;對新綠原酸的交叉反應(yīng)率為4. 870% ;對異綠原酸A的交叉反 應(yīng)率為17. 533% ;對異綠原酸B的交叉反應(yīng)率為0. 364% ;對異綠原酸C的交叉反應(yīng)率為 0. 776%;對咖啡酸的交叉反應(yīng)率為0. 010%;對奎尼酸、肉桂酸、阿魏酸、1，3-二咖啡奎尼酸 的交叉反應(yīng)率均小于〇. 001% ;而對綠原酸的交叉反應(yīng)率為100%，說明抗綠原酸單克隆抗 體特異性強。
[0099] 表2單克隆抗體與綠原酸及其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)
[0102] 實施例3、單克隆抗體的靈敏度檢測
[0103] 通過間接競爭ELISA實驗建立標準曲線，并確定檢測靈敏度為0. 39ng/mL，線性檢 測范圍在0. 10~I. 51ng/mL。具體方法如下：
[0104] 1、包被：取96孔酶標板，采用綠原酸-OVA溶液進行包被，100 μ L/孔；綠原酸-OVA 溶液的濃度為500ng/mL ;37°C包被3h，用洗滌液洗滌4次。
[0105] 2、加標準品溶液：每孔加入50 μ L綠原酸標準品溶液，綠原酸標準品溶液濃度依 次為：4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL 和 0· 0625ng/mL ;對照孔 為50 μ L的樣品稀釋液。
[0106] 3、加抗體：每孔加入50 μ L步驟五的2得到的單克隆抗體溶液的稀釋液（用樣品 稀釋液稀釋成500ng/mL);置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。
[0107] 4、加酶標二抗：將羊抗鼠酶標二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，購自Jackson公司，商品目 錄號為79556)稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。
[0108] 5、顯色：取20mg鄰苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀釋液中，加4 yL 30% H2O2，將底 物溶液加入酶標板中，每孔100 μ L。避光顯色15min。
[0109] 6、終止：每孔加入50 μ L終止液，用酶標儀492nm處測定各孔的OD值。
[0110] 7、繪制標準曲線：以不同濃度的綠原酸標準品溶液為橫坐標，B/B。?表示含有綠 原酸時的OD值，B。表示對照孔時的OD值）為縱坐標，運用OriginPro 8軟件繪制標準曲 線。實驗設(shè)3次重復(fù)，取三次實驗結(jié)果的平均值，得到的標準曲線如圖2所示。標準曲線方 程為 y = 〇· 01096+0. 97438Λ?+(χ/0· 39623Γ1. 06671) (R2= 0· 9988)。
[0111] 8、根據(jù)步驟7建立的標準曲線，定義Β/Β。數(shù)值為0. 5時對應(yīng)的綠原酸標準品濃度 為檢測靈敏度（即0. 39ng/mL)，定義Β/Β。數(shù)值分別為0. 2和0. 8時所對應(yīng)的綠原酸標準品 濃度范圍為該檢測方法的線性檢測范圍（即0. 10~I. 51ng/mL)。
[0112] 實施例4、檢測綠原酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
[0113] -、試劑盒的制備
[0114] 本發(fā)明的檢測綠原酸的酶聯(lián)免疫試劑盒由綠原酸-OVA溶液（包被原）、抗綠原酸 的單克隆抗體、羊抗鼠酶標二抗IgG-HRP、包被緩沖液、洗滌液、標準品溶液、底物緩沖液和 終止緩沖液和封閉液組成。其中，綠原酸-OVA溶液為實施例1中的步驟一制備得到的；抗 綠原酸的單克隆抗體為實施例1的步驟五中的2制備得到的。
[0115] 二、抗綠原酸的單克隆抗體在檢測樣品中綠原酸含量上的應(yīng)用
[0116] 使用步驟一的試劑盒對待測樣品（不同產(chǎn)地的金銀花）中的綠原酸含量進行檢 測，具體步驟如下：
[0117] 1、將待測樣品粉碎，經(jīng)50%甲醇超聲提取，得到提取液，將提取液直接檢測或加適 量樣品稀釋液稀釋成樣品溶液。
[0118] 2、包被：取96孔酶標板，采用綠原酸-OVA溶液進行包被，100 μ L/孔；綠原酸-OVA 溶液的濃度為500ng/mL ;37°C包被3小時，用洗滌液洗滌4次。
[0119] 3、加標準品溶液和待測樣品溶液：每孔加入50 μ L綠原酸標準品溶液和待測樣 品溶液；綠原酸溶液濃度為：4ng/mL、2ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 125ng/mL 和 0. 0625ng/mL ;對照孔為50 μ L的樣品稀釋液。
[0120] 4、加抗體：每孔加入50 μ L單克隆抗體溶液的稀釋液（用樣品稀釋液稀釋成 500ng/mL);置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。
[0121] 5、加酶標二抗：將羊抗鼠酶標二抗IgG-HRP (0. lmg/mL，購自Jackson公司，商品目 錄號為79556)稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下30min，洗板4次。
[0122] 6、顯色：取20mg鄰苯二胺（OPD)溶于IOmL底物稀釋液中，加4 μ L 30% H2O2，將 底物溶液加入酶標板中，每孔100 μ L。避光顯色15min。
[0123] 7、終止：每孔加入50 μ L終止液，用酶標儀492nm處測定各孔的OD值。
[0124] 8、繪制標準曲線：以不同濃度的綠原酸溶液為橫坐標，B/B。?表示含有綠原酸時 的OD值，B。表示對照孔的OD值）為縱坐標，運用OriginPro 8軟件繪制標準曲線。實驗 設(shè)3次重復(fù)，取三次實驗結(jié)果的平均值，得到的標準曲線如圖2所示。標準曲線方程為y = 0. 01096+0. 97438/(1+(χ/0. 39623) '1. 06671) (R2= 0. 9988) 〇
[0125] 9、將待測樣品的B/B。代入標準曲線中，根據(jù)標準曲線方程計算得到待測樣品中綠 原酸的含量，檢測結(jié)果見表3。
[0126] 表3、不同產(chǎn)地金銀花樣品中綠原酸含量檢測結(jié)果
【主權(quán)項】
1. 抗綠原酸的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 10880的雜交瘤細胞株分泌的。2. -株分泌抗綠原酸的單克隆抗體的雜交瘤細胞株CGAID 7，其保藏號為CGMCC No.10880。3. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或權(quán)利要求2所述的雜交瘤細胞株CGA1D7在檢測或 輔助檢測待測樣品中綠原酸含量中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或權(quán)利要求2所述的雜交瘤細胞株CGA1D7在制備檢 測或輔助檢測待測樣品中綠原酸含量的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或權(quán)利要求2所述的雜交瘤細胞株CGA1D7在制備檢 測或輔助檢測待測樣品中綠原酸含量的膠體金試紙條中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或權(quán)利要求2所述的雜交瘤細胞株CGA1D7在比較或 輔助比較待測樣品中綠原酸含量高低中的應(yīng)用。7. -種檢測或輔助檢測待測樣品中綠原酸含量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括獨立包裝的權(quán) 利要求1所述的單克隆抗體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：所述樣品為金銀花。9. 權(quán)利要求7或8所述的酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品中綠原酸含量中 的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述樣品為金銀花。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測綠原酸的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的專用酶聯(lián)免疫試劑盒所使用的抗綠原酸的單克隆抗體是由雜交瘤細胞株CGMCC？No.10880分泌產(chǎn)生的。通過實驗證明：本發(fā)明所提供抗綠原酸的單克隆抗體特異性強，對隱綠原酸的交叉反應(yīng)率為1.926％；對新綠原酸的交叉反應(yīng)率為4.870％；對異綠原酸A的交叉反應(yīng)率為17.533％；對異綠原酸B的交叉反應(yīng)率為0.364％；對異綠原酸C的交叉反應(yīng)率為0.776％；對咖啡酸的交叉反應(yīng)率為0.010％。利用該單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于定性或定量檢測樣品中綠原酸，線性檢測范圍在0.10～1.51ng/mL，具有快速、靈敏的優(yōu)點。CGMCC No. 1088020150602
【IPC分類】C07K16/44, G01N33/577, C12N5/20, C12R1/91
【公開號】CN105017426
【申請?zhí)枴緾N201510437984
【發(fā)明人】黃璐琦, 張波, 南鐵貴, 袁媛, 詹志來, 康利平
【申請人】中國中醫(yī)科學院中藥研究所
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月23日