在一段時(shí)間之后重復(fù)步驟(i)至(V)，從而隨著時(shí)間分析一種組分流體的組成。在此實(shí)施例中，該方法可以用于監(jiān)控該組分流體的改變，如這些組分的聚集或者可以是一種聚集物的一種組分到更小部分的分離。在此描述了一種用于分析淀粉樣蛋白的聚集物的方法。
[0256]在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括步驟(vi)，其中一種組分的一個(gè)擴(kuò)散系數(shù)值是由步驟(V)的徑向擴(kuò)散測(cè)量值確定的，并且任選地一個(gè)流體動(dòng)力學(xué)半徑是由一個(gè)擴(kuò)散系數(shù)值確定的。
[0257]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(vi)包括比較來自步驟(V)的一種或多種組分的測(cè)量的徑向擴(kuò)散曲線與具有已知流體動(dòng)力學(xué)半徑的組分的一系列分布，從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動(dòng)力學(xué)半徑。
[0258]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(vi)包括使用關(guān)于具有已知流體動(dòng)力學(xué)半徑的組分的一系列分布的一種最高熵正規(guī)化方法，使來自步驟(V)的一種或多種組分的測(cè)量的徑向擴(kuò)散曲線去卷積，從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動(dòng)力學(xué)半徑。在此實(shí)施例中，可以使用一種最小平方分析。具有已知流體動(dòng)力學(xué)半徑的組分的該系列分布可以是一系列預(yù)測(cè)的分布。
[0259]在本發(fā)明的一種替代方法中，提供了一種用于測(cè)定一種或多種組分的擴(kuò)散系數(shù)的方法，該方法包括以下步驟:
[0260](i)提供包含一種或多種組分的一個(gè)組分流體流；
[0261](ii)提供一個(gè)空白流體流；
[0262](iii)在一個(gè)通道中使該流⑴與該流(ii)接觸，從而生成兩個(gè)層流；
[0263](iv)在多個(gè)擴(kuò)散時(shí)間測(cè)量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴(kuò)散。
[0264]在測(cè)量點(diǎn)之間的分離沒有特別限制，但是可以具有足夠的距離，使得所記錄的擴(kuò)散曲線在測(cè)量點(diǎn)之間顯著改變。
[0265]以上所討論的流速、體積和溫度也可適用于此方法。
[0266]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的第一方面和第二方面的特征可以被有利地組合，以提供一種用于以提高的準(zhǔn)確度分析一種組分流體的方法。該方法因此可以包括以下步驟:
[0267](i)提供包含一種或多種組分的一個(gè)組分流體流；
[0268](ii)提供一個(gè)空白流體流；
[0269](iii)在一個(gè)大橫截面通道中使流⑴與流(ii)接觸，從而生成兩個(gè)層流；
[0270](iv)允許在(iii)中生成的這些層流從大橫截面通道中流入一個(gè)小橫截面通道中；
[0271](V)在多個(gè)擴(kuò)散時(shí)間測(cè)量一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴(kuò)散。
[0272]使用大橫截面通道的優(yōu)點(diǎn)和記錄多個(gè)擴(kuò)散曲線的優(yōu)點(diǎn)因此可以集合在一起。
[0273]其他參數(shù)選擇
[0274]在此明確披露了以上所述的實(shí)施例的各個(gè)和每個(gè)相容性組合，就像單獨(dú)地且明確地?cái)⑹龈鱾€(gè)和每個(gè)組合一樣。
[0275]鑒于本披露，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的多個(gè)不同的其他方面和實(shí)施例。
[0276]在此使用的“和/或”應(yīng)當(dāng)理解為明確地公開了兩個(gè)具體特征或組件中的每一個(gè)(具有或不具有另外一個(gè))。例如，“A和/或B”應(yīng)當(dāng)理解為明確地披露了(i)A、(ii)B和
(iii)A和B中的每一種情況，就像在此單獨(dú)地列出每一種情況一樣。
[0277]除非上下文中另外指出，否則上述列出的特征的描述和定義并不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓绞?，并且等同地?yīng)用于所描述的所有方面和實(shí)施例。
[0278]現(xiàn)在將僅借助于實(shí)例并參照以上所述的附圖來說明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施例。
[0279]實(shí)驗(yàn)
[0280]使用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕技術(shù)[20，14]將微流體通道制造成在硅掩膜上具有SU-8光刻膠的聚二甲基硅氧烷(PDMS ;道康寧公司(Dow Corning)) ο將這些通道等離子體結(jié)合至玻璃載片，以形成密封裝置。該通道高度是25 μπι。通道寬度在該裝置的不同區(qū)域是不同的-在小橫截面通道中該寬度是300 μ m，在噴嘴處從3，000 μ m收縮(大橫截面通道)。將緩沖液(空白)流體和分析物流體引入該噴嘴中的通道的寬度是ΙΟΟμπι。用于在此所述的實(shí)驗(yàn)中的裝置示出在圖1a和圖1b中。在以下還描述了另外的制備詳情。
[0281]注射器泵(哈佛儀器(Harvard Apparatus))用于控制流體流。
[0282]用于本發(fā)明的25nm和10nm膠質(zhì)是來自西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich)的聚苯乙烯膠質(zhì)，它是在用熒光素預(yù)先標(biāo)記的情況下供應(yīng)的。這些膠質(zhì)被提供在去離子水中。所使用的流速典型地是4 μ L/h。
[0283]用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是胰高血糖素、乳球蛋白和牛血清白蛋白，它們?nèi)慷伎蓮奈鞲瘳攰W德里奇公司獲得。這些蛋白質(zhì)是熒光標(biāo)記的。這些蛋白質(zhì)被提供在具有20%DMSO的pH 8 50mM磷酸鹽緩沖液中。用于蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)的流速典型地是40 μ L/h。
[0284]這些組分在該通道中的擴(kuò)散是通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)穿過通道進(jìn)行熒光檢測(cè)來測(cè)量的(也參見耶格爾等人[11]等)。暴露時(shí)間典型地是10S。
[0285]將Αβ (1-42)克隆到“PetSacKan”質(zhì)粒中，在大腸桿菌BL21細(xì)胞中重組表達(dá)，并且使用陰離子交換色譜法以分批模式進(jìn)行純化。此程序允許產(chǎn)生大量的高純度肽[18]。將所得的肽分成ImL等分試樣，將其凍干并保存在_20°C，直到進(jìn)一步使用為止。
[0286]擴(kuò)散光譜法研宄復(fù)合蛋白質(zhì)締合過程如在此所述的那些過程的應(yīng)用依賴于使用最近詳細(xì)報(bào)道的一種非微擾性共價(jià)標(biāo)記技術(shù)?？紤]到擴(kuò)散光譜法的主要優(yōu)點(diǎn)是其獲得一種異質(zhì)混合物中的顆粒大小的光譜的能力，從而選定允許擴(kuò)散流動(dòng)在觀察下可視化的一種標(biāo)記技術(shù)，熒光共價(jià)標(biāo)記是最佳方法。熒光標(biāo)記有助于使用一個(gè)常規(guī)光學(xué)顯微鏡檢查設(shè)置來方便采集高信噪比圖像。共價(jià)標(biāo)記確保該異質(zhì)混合物內(nèi)的所有物質(zhì)被標(biāo)記并且因此能夠被檢測(cè)。在歷史上，蛋白質(zhì)復(fù)合物的共價(jià)熒光標(biāo)記是具有挑戰(zhàn)性的。如果用一種熒光染料標(biāo)記所形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，未結(jié)合染料必須在分析之前從反應(yīng)混合物中去除，并且所需的純化步驟破壞了瞬時(shí)形成的締合物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
[0287]或者，個(gè)別蛋白質(zhì)可以在其締合之前被標(biāo)記并從未結(jié)合染料中純化，但是甚至一種熒光報(bào)道基因的位點(diǎn)特異性安裝較大或較小程度上破壞了復(fù)合物締合。在此，用一種潛在熒光團(tuán)標(biāo)記所形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。因?yàn)閮H標(biāo)記的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物是熒光的，所以不需要純化步驟，并且熒光標(biāo)記物質(zhì)的異質(zhì)混合物用擴(kuò)散光譜法直接分析。
[0288]在堿性pH下并且在一種硫醇(在此，β-巰基乙醇，BME)存在下，在蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的表面上暴露的胺與鄰-苯二醛(OPA)反應(yīng)以在原位形成一種雙環(huán)、異吲哚型熒光團(tuán)[15、16]。
[0289]盡管最初觀察到此過程的快速動(dòng)力學(xué)[2]，它對(duì)于分析蛋白質(zhì)混合物的應(yīng)用通常限于針對(duì)后置柱或前置柱肽衍化[13、17]或者針對(duì)生物組織內(nèi)少量氨基酸的定量檢測(cè)[21,6]的努力。
[0290]本發(fā)明的示例性裝置
[0291]圖1a和圖1b是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的一種微流體裝置的示意圖。圖1a是所使用的一種裝置的3D表示圖，該裝置具有一個(gè)組分流體流和多個(gè)空白流體流，在該表示圖中具有分析物在噴嘴處的分布的插圖以及在從如下所述的小橫截面通道開始的1_、3_和9mm處的三個(gè)測(cè)量點(diǎn)的插圖。圖1b是該裝置的平面圖。
[0292]圖1a示出了在小橫截面通道中的牛血清白蛋白和β乳球蛋白的一種混合物的擴(kuò)散。
[0293]用于本發(fā)明的一種裝置I可以包括在一個(gè)噴嘴的一個(gè)接頭處接觸一個(gè)空白流體流供應(yīng)通道3a的一個(gè)組分流體流供應(yīng)通道2，該噴嘴是一個(gè)大橫截面通道4。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，提供兩個(gè)空白流體流供應(yīng)通道3a和3b，如圖1b所示的。該組分流體流供應(yīng)通道2可以是與一個(gè)上游組分流體儲(chǔ)罐5流體連通的，該組分流體儲(chǔ)罐可以包括一個(gè)可控注射器或者可以是該可控注射器的一部分(未示出)。每個(gè)空白流體流供應(yīng)通道3a和3b可以是與一個(gè)上游空白流體儲(chǔ)罐6流體連通的，該空白流體儲(chǔ)罐可以包括一個(gè)可控注射器或者可以是該可控注射器的一部分(未示出)。一個(gè)儲(chǔ)罐6可以供應(yīng)兩個(gè)空白流體流通道3a和3b ο
[0294]在大橫截面通道下游并且與其流體連通的是一個(gè)小橫截面通道7。該小橫截面通道7可以具有一個(gè)彎曲(旋繞)路徑，如圖1b所示的。該小橫截面通道7被適配為與一個(gè)分析檢測(cè)器(未示出)一起使用，該分析檢測(cè)器可以被安排來在沿著小橫截面通道7的一個(gè)或多個(gè)位置處分析存在于該通道中的一個(gè)流體中的多種組分。該分析檢測(cè)器可以被安排為穿過小橫截面通道的兩個(gè)或更多個(gè)截面同時(shí)檢測(cè)一個(gè)流體中的多種組分，如通過檢測(cè)區(qū)域8說明性地示出的。該小橫截面通道可以是與一個(gè)下游收集儲(chǔ)罐9流體連通的。
[0295]大橫截面通道4典型地具有一個(gè)橫截面，該橫截面是該小橫截面通道7的橫截面的十倍。因此，在圖1a中，插圖顯示該小橫截面通道7的寬度是300 ym(這在9mm圖像中是清楚的，其中該組分已擴(kuò)散到空白流體流的邊緣，其中該流體接觸該通道壁)。大橫截面通道4具有3，000 μ m的最大寬度。
[0296]大橫截面通道4具有從該接頭延伸的恒定寬度的一個(gè)區(qū)域。然后該通道逐漸減小(以與該流體流動(dòng)方向成約60°的角度)，直到該通道是小橫截面通道7的寬度為止。大橫截面通道7從該接頭(其中該組分流體供應(yīng)通道和空白流體供應(yīng)通道相遇)到小橫截面通道7開始的長(zhǎng)度可以是約ΙΟΟμπι。
[0297]小橫截面通道7的寬度在其整個(gè)路徑上保持基本上恒定。小橫截面通道7從其中大橫截面通道4結(jié)束的點(diǎn)開始到儲(chǔ)罐9的長(zhǎng)度可以是在1mm的范圍內(nèi)。
[0298]本發(fā)明的裝置用于分析在一個(gè)流體中的一種組分如一種多肽的半徑，并且優(yōu)選地分析多種組分的個(gè)別半徑。提供作為一個(gè)射流裝置的一個(gè)流的組分流體并且測(cè)量在流體流中的每種組分到一個(gè)相鄰空白流體流中的擴(kuò)散。該空白流體是缺乏該組分的一個(gè)流體。
[0299]射流裝置I可以是使用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕技術(shù)、使用例如聚二甲硅氧烷作為基底材料來制備的。適合的光刻膠可以是根據(jù)所需的流體流通道和儲(chǔ)罐的形狀和尺寸來制備的。
[0300]在使用時(shí)，一個(gè)組分流體被提供到該儲(chǔ)罐5中并且被允許流過該組分流體供應(yīng)通道2，流到該大橫截面通道4中，在該大橫截面通道中它接觸空白流體流。這些空白流體被提供到儲(chǔ)罐6并且被允許流過這些組分流體供應(yīng)通道3a和3b，流到該大橫截面通道4。流速可以是通過注射器泵控制的，該注射器泵供應(yīng)這些供應(yīng)通道2、3a和3b?；蛘?，該流動(dòng)是來自儲(chǔ)罐5和6的流體的一個(gè)重力供料。
[0301]該組分流體流和這些空白流體流在大橫截面通道4中接觸并且在這些空白流體流之間形成該組分流體流的一個(gè)層流。這些流被允許從大橫截面通道4向下游流入小橫截面通道7。在組分流體流內(nèi)的多種組分被允許從組分流體流中擴(kuò)散到這些空白流體流中。這些組分的擴(kuò)散可以是在沿著小橫截面通道7的一個(gè)或多個(gè)位置處，例如在檢測(cè)區(qū)域8中測(cè)量。典型地，在一個(gè)組分(如最小的組分)已到達(dá)該空白流體流的邊緣之前獲取第一個(gè)測(cè)量值，其中該流體接觸該通道壁。一旦進(jìn)行適當(dāng)數(shù)目的擴(kuò)散測(cè)量，就可以在一個(gè)儲(chǔ)罐9中收集這些流體流或者就可以允許這些流體流流入到一個(gè)第二分析裝置中，該第二分析裝置是與流體裝置I流體連通的。在圖1a中示出了在小橫截面通道7的長(zhǎng)度上的擴(kuò)散曲線，其中可見白色的組分?jǐn)U散到較黑的空白流體流中。
[0302]本發(fā)明人已確定在用于檢測(cè)組分?jǐn)U散的射流裝置中使用一個(gè)大橫截面通道提供了允許更準(zhǔn)確地測(cè)定一個(gè)流體中的多種組分的半徑的一些益處。使用該裝置引起用于組分流中的這些組分的良好限定的初始構(gòu)型，該初始構(gòu)型從其中組分流和空白流進(jìn)入小寬度通道7的一點(diǎn)開始。在例如小橫截面通道7下游的通道中建立一個(gè)恒定速度曲線之前，使用一個(gè)大流動(dòng)通道4使組分的擴(kuò)散最小化，在該小橫截面通道中進(jìn)行擴(kuò)散測(cè)量。
[0303]圖4示出使用比小橫截面通道寬十倍的一個(gè)大橫截面通道引起一個(gè)清潔且限定的組分流。在圖4中，示出了從一個(gè)組分流體供應(yīng)通道進(jìn)入一個(gè)大橫截面通道中的一個(gè)組分流體流(白色)的三個(gè)圖像。在大橫截面通道中的組分流體流似乎是相對(duì)清潔的并且從組分流體第一次接觸該空白流體流(灰色)的一點(diǎn)來限定。
[0304]描述圖1a和圖1b的微流體裝置的制備的一個(gè)有用的實(shí)例列出在以下α -B晶狀體蛋白實(shí)驗(yàn)中。
[0305]多組分混合物的分析
[0306]使用以上所述的微流體裝置分析包含等量(按體積計(jì)0.02% )的25nm和10nm膠質(zhì)的一種含水混合物。還制備每種膠質(zhì)的個(gè)別溶液。使溶液以40 μ LtT1流過該裝置并且在480nm使用一個(gè)LED光源照射.使用高量子產(chǎn)率CXD照相機(jī)獲取三次1s暴露，在三個(gè)測(cè)量點(diǎn)中每一個(gè)點(diǎn)處獲取一次暴露.
[0307]在三個(gè)不同的擴(kuò)散時(shí)間在從小橫截面通道開始的1_、3mm和9_處測(cè)量擴(kuò)散曲線(參見圖2，底部圖)。使用在此所述的一種最高熵正規(guī)化方法使擴(kuò)散曲線的組合去卷積，以顯示具有不同流體動(dòng)力學(xué)半徑的兩種組分的存在(圖2，底部光譜)，該流體動(dòng)力學(xué)半徑非常緊密配合對(duì)于個(gè)別膠質(zhì)所測(cè)定的實(shí)驗(yàn)來源的值(頂部光譜和從頂部光譜起的第二個(gè)光譜)。對(duì)于比較，進(jìn)行一個(gè)單個(gè)擴(kuò)散曲線的去卷積(從底部光譜起的第二個(gè)光譜)。如可以看出，此去卷積錯(cuò)誤地表明在該混合物中的三種不同組分的存在，其中具有一個(gè)較小半徑的組分被分辨為兩個(gè)單獨(dú)的信號(hào)。此外，具有一個(gè)較大半徑的組分被分辨為具有一個(gè)較高半徑的一個(gè)信號(hào)。使用多個(gè)測(cè)量點(diǎn)因此在擴(kuò)散曲線的去卷積中提供更大準(zhǔn)確度和更大分辨率。
[0308]微流體擴(kuò)散技術(shù)也可以用于分辨蛋白質(zhì)的多組分混合物。對(duì)于蛋白質(zhì)胰高血糖素、乳球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)的混合物進(jìn)行一個(gè)第二校準(zhǔn)。將每種蛋白質(zhì)制備為含有20% DMSO的磷酸鹽緩沖液中的一種均質(zhì)溶液以及為該三種蛋白質(zhì)的一種1:1:1混合物(按質(zhì)量計(jì))，DMSO用于確保在實(shí)驗(yàn)過程中所有蛋白質(zhì)保持在單體狀態(tài)并且沒有形成未知復(fù)合物。
[0309]這三個(gè)蛋白質(zhì)是熒光標(biāo)記的。在此，用一個(gè)潛在熒光團(tuán)標(biāo)記所形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，即僅在結(jié)合時(shí)是熒光的并且如果游離在溶液中則檢測(cè)到。因?yàn)閮H標(biāo)記的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物是熒光的，所以不需要純化步驟，并且熒光標(biāo)記物質(zhì)的異質(zhì)混合物用擴(kuò)散光譜法直接分析。在堿性pH下并且在一種硫醇(在此，β-巰基乙醇，BME)存在下，在蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的表面上暴露的胺與鄰-苯二醛(OPA)反應(yīng)以在原位形成一種雙環(huán)、異吲哚型熒光團(tuán)。
[0310]以與以上相同的方式進(jìn)行擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中使用的照射波長(zhǎng)是365nm。圖6示出了對(duì)個(gè)別和組合的測(cè)試溶液的擴(kuò)散測(cè)量的結(jié)果。在與均質(zhì)溶液中大小類似的大小的混合物中分辨三種物質(zhì)，盡管與β乳球蛋白和牛血清白蛋白對(duì)應(yīng)的峰稍微更靠近地一起偏移。這可能是實(shí)驗(yàn)中的隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差的作用，并且這兩個(gè)峰在此信噪比水平下接近于微流體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的分辨力。
[0311]BSA的分析
[0312]當(dāng)表征單分散溶液如單一蛋白質(zhì)時(shí)，微流體擴(kuò)散技術(shù)可能是極其精密的。如所證明的，微流體擴(kuò)散用于研宄溶解于PH 7和溶解于具有80% DMSO的相同緩沖液中的蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的流體動(dòng)力學(xué)半徑的變化。
[0313]將5mg/mL的BSA溶解于pH 7磷酸鹽緩沖液(例如，5mM HEPES緩沖液)，之后在β-巰基乙醇(BME)存在下用OPA進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記混合物是12mM 0PA、18mM BME,4%SDS以及200mM碳酸鹽的溶液，pH在范圍9.5-10.5內(nèi)。提前制備該溶液并且以與蛋白質(zhì)溶液的1:1體積比率混合。
[0314]然后在相同緩沖液和DMSO中將此標(biāo)記的BSA的儲(chǔ)備溶液稀釋至lmg/mL(其中最終DMSO濃度是按體積計(jì)80% )。使用與以上詳述的多組分混合物相同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)量每種溶液(緩沖液和80% DMS0)中的BSA的流體動(dòng)力學(xué)半徑。
[0315]圖7示出了對(duì)于每種BSA溶液計(jì)算的擴(kuò)散系數(shù)。在水性緩沖液中的BSA的擴(kuò)散系數(shù)與流體動(dòng)力學(xué)半徑3.5nm相對(duì)應(yīng)，這可與文獻(xiàn)值相比。在80% DMSO中，該蛋白質(zhì)是顯著展開的，其中流體動(dòng)力學(xué)半徑是6+0.5nm。
[0316]胰島素聚集事件的分析
[0317]本發(fā)明的方法可以用于研宄單體、二聚體和六聚體形式的胰島素共存。胰島素(可從商業(yè)來源獲得)可以是在生理pH下共價(jià)標(biāo)記的?？梢噪S著時(shí)間測(cè)量一種胰島素樣品的組成的變化。因此，可以從該樣品中取出等分試樣并且使用本發(fā)明的一種擴(kuò)散方法進(jìn)行測(cè)試。擴(kuò)散曲線的變化可以與該樣品、例如增加的聚集物的組成變化連接。還可以在胰島素樣品的pH變化的情況下監(jiān)控聚集物的變化。例如，可以在pH 2和pH 4下測(cè)定聚集物?？梢员容^在這些樣品中的不同物質(zhì)的群體。
[0318]Αβ (1-42)聚集事件的分析
[0319]擴(kuò)散光譜法可以用于分析蛋白質(zhì)復(fù)合物的高異質(zhì)混合物。用于研宄的一種特別具有挑戰(zhàn)性的類型的生物分子締合方法是富含異常β折疊的聚集物的形成方法:該聚集物通常被稱為淀粉樣原纖維。淀粉樣，特別是低聚物形式，涉及阿爾茨海默病的主要致病因素之一。在蛋白質(zhì)溶液經(jīng)受聚集時(shí)獲得它的一個(gè)大小分布對(duì)于理解疾病病理學(xué)和聚集的潛在機(jī)制是重要的。
[0320]通常使用原子力顯微鏡獲得淀粉樣聚集物的大小分布。然而，AFM技術(shù)通常需要降低樣品的濃度，這意味著在可以進(jìn)行測(cè)量之前動(dòng)態(tài)復(fù)合物可以解離。AFM還在發(fā)現(xiàn)真實(shí)大小分布方面具有問題，因?yàn)榉治鑫镌谝粋€(gè)表面上的分布很少是均勻的。擴(kuò)散光譜法是一種整體技術(shù)(bulk technique)，并且擴(kuò)散時(shí)間是足夠短的，使得樣品溶液的組成在其沿著擴(kuò)散通道行進(jìn)的整個(gè)過程應(yīng)保持不變。實(shí)際上，每個(gè)分子在該裝置內(nèi)僅花費(fèi)約10秒或20秒。另外，用于分析的物質(zhì)僅稀釋至多系數(shù)十，這使得解離最小化。
[0321]圖3示出了在從單體蛋白質(zhì)開始的一個(gè)聚集反應(yīng)中的四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的Αβ (1-42)聚集物的大小分布。擴(kuò)散測(cè)量值的詳情與以上詳述的其他蛋白質(zhì)溶液的詳情相同，盡管在每個(gè)測(cè)量點(diǎn)使用10s暴露時(shí)間而不是10s。
[0322]在反應(yīng)開始時(shí)，該肽是單體的，如所預(yù)期的。感興趣的是，較大物質(zhì)的一個(gè)峰開始出現(xiàn)在時(shí)間進(jìn)程中的僅30分鐘，在ThT熒光強(qiáng)度已明顯增加之前。這些較大物質(zhì)具有一個(gè)大小范圍跨越的低聚物至小原纖維，并且假定缺乏締合的ThT信號(hào)，則可能的是大部分峰包括被認(rèn)為與疾病有關(guān)的小的、ThT陰性低聚物。在50分鐘之后，在反應(yīng)生長(zhǎng)期開始時(shí)，仍存在大部分的單體以及先前觀察到的低聚物和原纖維的混合物。存在流體動(dòng)力學(xué)半徑的較大大小高至約20nm的大量原纖維群，并且在此時(shí)首先出現(xiàn)聚集的原纖維的外觀(在大約400nm處的峰)。在已消耗所有單體的時(shí)候，在120分鐘時(shí)，在這些大原纖維團(tuán)中包含所有這些聚集物。
[0323]實(shí)驗(yàn)
[0324]將Αβ (1-42)克隆到“PetSacKan”質(zhì)粒中，在大腸桿菌BL21細(xì)胞中重組表達(dá)，并且使用陰離子交換色譜法以分批模式進(jìn)行純化。此程序允許以相對(duì)高的純度產(chǎn)生大量的肽。將所得的肽分成ImL等分試樣，將其凍干并保存在-20°C，直到進(jìn)一步使用為止。盡管獲得Αβ (1-42)肽聚集物的可再生動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在歷史上是具有挑戰(zhàn)性的[10]，但是最近已顯示在聚集反應(yīng)之前立即進(jìn)