射流裝置的制造方法
【專利說明】射流裝置
[0001]相關(guān)申請
[0002]本案要求2012年10月23日(23/10/2012)提交的GB 1219014.6的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，該申請的內(nèi)容通過弓I用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及用于分析組分混合物如多肽混合物的流動擴(kuò)散方法和流動儀器。
【背景技術(shù)】
[0004]基本上重要或技術(shù)上重要的很多系統(tǒng)作為多種異質(zhì)組分的多分散混合物存在。在此類混合物中個別組分的固有特性的說明在從分析化學(xué)到生物物理學(xué)范圍的領(lǐng)域內(nèi)是一個決定性問題。
[0005]異質(zhì)顆?；旌衔镏械念w粒大小測量在由藥物延伸的領(lǐng)域中是一個常見的問題，其中大小測量判斷治療劑到顏料、油墨和涂料的溶解性和純度，所有這些的納米和微尺度組分的大小必須受到嚴(yán)密地控制和監(jiān)控以確保所希望的功能。
[0006]其中微尺度組分的大小是特別重要的并且具有大的定義重要性的領(lǐng)域是蛋白質(zhì)締合和自組裝的領(lǐng)域；絕大部分蛋白質(zhì)不是作為單體物質(zhì)而是作為較大功能性復(fù)合物的一部分來實踐其生物功能；如果沒有出現(xiàn)以希望的方式將蛋白質(zhì)組裝成此類復(fù)合物而是形成異常物質(zhì)，則此異常組裝頻繁地導(dǎo)致機能障礙和疾病。通常用于測量多肽大小的現(xiàn)有生物物理學(xué)技術(shù)表現(xiàn)最好以用于均質(zhì)制備純化的組分，而具有很多生物系統(tǒng)特征的均質(zhì)混合物的定量研宄仍具有挑戰(zhàn)性。
[0007]基于現(xiàn)有微流體擴(kuò)散的定量技術(shù)[I]主要涉及發(fā)現(xiàn)均質(zhì)溶液[5]中的一種單一物質(zhì)的大小或者典型地使用熒光標(biāo)記的物質(zhì)[8、7、3、11、12、19]測量兩種分離的物質(zhì)之間的相互作用。還報道了不需要熒光標(biāo)記樣品的技術(shù)[4]。
[0008]例如，耶格爾(Yager)等人[11]描述了一種用于光學(xué)測量微通道中的橫向分子擴(kuò)散的T-傳感器。該T-傳感器具有兩個輸入端口，通過這些端口提供一個含分析物流體和一個緩沖液流體。兩個流體物流在T型接頭處接觸并且被允許沿著一個檢測通道并排地流動。在這些流沿著該通道行進(jìn)時，分析物從分析物流體擴(kuò)散到緩沖液流體中。作者使用若干種熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)作為測試分析物，并且這些蛋白質(zhì)的擴(kuò)散是通過在該接頭下游的一個測量位置處進(jìn)行熒光顯微鏡檢查來檢測的。所述的方法集中于單分散分析物溶液的分析。
[0009]耶格爾等人注意到由所記錄的實驗擴(kuò)散數(shù)據(jù)計算的擴(kuò)散系數(shù)值包括誤差，該誤差涉及在計算中這些流體在整個檢測通道中具有一個充分展開的速度曲線的假設(shè)。這個假設(shè)是不正確的，如作者所解釋的。實際上，觀察到流體的速率沿著該通道從這些流體首先接觸的停滯點(在該接頭處的零級流動區(qū)域)開始加快到也在下游一個點處充分展開的速率。為了補償較緩慢的流體流動的此區(qū)域，作者描述了解釋并定量流動發(fā)展的計算方法。作者自己承認(rèn)，這些溶液的數(shù)值計算是粗糙的，緩慢計算(約I天的計算時間)，并且僅可以給出關(guān)于在所謂流動發(fā)展區(qū)域中擴(kuò)散效應(yīng)大小的意見。由此，由記錄的數(shù)據(jù)計算的擴(kuò)散系數(shù)不能適當(dāng)?shù)匮a償在T型接頭處的流體停滯。
[0010]US 2006/263903描述了加號(+)形狀的微通道網(wǎng)絡(luò)測定一種樣品溶質(zhì)的分子量和擴(kuò)散率的用途。在此，一個單一分析物流體流在一個交叉點與一個單一空白流體流接觸。這些流隨后分離，其中每個流在一個單獨的出口通道中離開該接觸區(qū)域。對于一個范圍的不同分析物和空白流體流速，測定已分散到接觸區(qū)域中的空白流體流中的分析物的量。分析物的擴(kuò)散率和分子量是通過比較所記錄的擴(kuò)散曲線與由標(biāo)準(zhǔn)分子的擴(kuò)散生成的一個擴(kuò)散率曲線數(shù)據(jù)組來測定的。所述的方法集中于單分散分析物溶液的分析。
[0011]本領(lǐng)域還已知用于基于一個流體通道中的一種物質(zhì)的泰勒(Taylor)分散確定擴(kuò)散特征的替代性射流方法。例如，US 2011/264380描述了用于測定多分散物質(zhì)的流體動力學(xué)半徑的方法。將有待分析的物質(zhì)與一個單分散標(biāo)準(zhǔn)混合。將所得的混合物添加到沿著一個毛細(xì)管流動的一個載體流體中并且在該混合物排出該毛細(xì)管時記錄它的泰勒曲線。
[0012]如US 2011/284380所注意到的，泰勒分散方法不適用于多分散混合物，因為所獲得的結(jié)果簡單地是一個平均信號，該平均信號反映了該混合物的全局特征而不是該混合物中每種組分的單個貢獻(xiàn)。US 2011/264380通過使用一種多分散樣品內(nèi)的一個內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)來部分解決這一點，該標(biāo)準(zhǔn)提供了對該平均信號的一個已知貢獻(xiàn)。例如，在分析一種多分散聚合物產(chǎn)品的情況下，可以存在一種單體前體的一種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。然后可以推導(dǎo)出多分散物質(zhì)對于總體信號的貢獻(xiàn)，并且可以測定多分散物質(zhì)的平均流體動力學(xué)半徑。然而，此方法僅可以提供一種多分散混合物的平均流體動力學(xué)半徑。此外，基于泰勒分散的方法需要一個擴(kuò)散的時間分辨的測量，這與通過耶格爾等人[11]描述的穩(wěn)態(tài)方法相比典型地具有一個更低的敏感度。
[0013]本發(fā)明人已開發(fā)了考慮到在流動通道中分析組分?jǐn)U散的這些問題的分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明大體上提供了一種用于測定一種組分、包括一種多分散組分混合物的擴(kuò)散系數(shù)的方法。具體地說，該方法可用于測定在一種混合物中的一種組分、優(yōu)選地兩種或更多種組分的流體動力學(xué)半徑。本發(fā)明方法特別適用于分析聚合物混合物如蛋白質(zhì)混合物。還提供了一種用于分析方法中的射流裝置。
[0015]本發(fā)明的方法和裝置可用于以比現(xiàn)存方法提高的準(zhǔn)確度測定一種組分的擴(kuò)散系數(shù)和流體動力學(xué)半徑。在一些方面，本發(fā)明的方法和裝置解決了在一個微型通道中的流體停滯的問題并且使得從停滯點延伸的流體發(fā)展區(qū)域最小化，從而允許在一個減小的時間內(nèi)形成一個穩(wěn)定流。
[0016]本發(fā)明的方法允許有待隨著時間測量的一種或多種組分的擴(kuò)散。以這種方式，該方法可以用于研宄這些流體的組成變化，并且更具體地說用于研宄一種組分以另一種相同組分或一種不同的組分的相互作用。例如，本發(fā)明可以用于監(jiān)控這些流體中的組分的聚集，如多肽的聚集。一種混合物隨著時間的擴(kuò)散曲線變化可以用于進(jìn)行組分聚集物的生成和分離。
[0017]使用擴(kuò)散方法的另一個一般優(yōu)點是研宄天然狀態(tài)下的生物分子如蛋白質(zhì)的機會。
[0018]在本發(fā)明的一個第一方面，提供了一種用于測定一種或多種組分的擴(kuò)散系數(shù)的方法，該方法包括以下步驟:
[0019](i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流；
[0020](ii)提供一個空白流體流；
[0021](iii)在一個大橫截面通道中使該流(i)與該流(ii)接觸，從而生成兩個層流；
[0022](iv)允許在(iii)中生成的這些層流從該大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中；
[0023](V)在該小橫截面通道中測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴(kuò)散。
[0024]在一個實施例中，在該方法中的步驟(i)提供一種包含一種或多種組分的組分流體流。
[0025]在一個實施例中，該組分流體流和該空白流體流是水流。
[0026]在一個實施例中，在步驟(ii)中提供兩個空白流，并且這些空白流被提供在大橫截面通道的組分流的一側(cè)，從而在步驟(iii)中在大橫截面通道中生成三個層流。
[0027]在本發(fā)明的一個第二方面，提供了一種用于本發(fā)明的第一方面的方法中的射流裝置，該裝置包括與兩個上游供應(yīng)通道流體連通的一個大橫截面通道和與大橫截面通道流體連通的一個下游小橫截面通道。
[0028]在本發(fā)明的第一方面的方法中，這些供應(yīng)通道可以被提供用于一個組分流體流和一個空白流體流。射流裝置被適配為用于檢測流體流中的一種或多種組分的一種分析裝置。該分析裝置用于測量一種或多種組分在一個小橫截面通道中的擴(kuò)散。
[0029]在一個流體中存在多于一種組分的情況下，在此所述的方法允許測定每個組分的擴(kuò)散系數(shù)，而不是組分混合物的一個平均擴(kuò)散系數(shù)。記錄的擴(kuò)散曲線的去卷積可以通過在不同擴(kuò)散時間記錄多個擴(kuò)散曲線，這具有減小記錄的數(shù)據(jù)的噪音水平的益處。
[0030]在本發(fā)明的一個第三方面，提供了一種用于測定一種或多種組分的擴(kuò)散系數(shù)的方法，該方法包括以下步驟:
[0031](i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流；
[0032](ii)提供一個空白流體流；
[0033](iii)在一個通道中使該流⑴與該流(ii)接觸，從而生成兩個層流；
[0034](iv)在多個擴(kuò)散時間，例如在三個或更多個擴(kuò)散時間測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴(kuò)散。
[0035]提到多個擴(kuò)散時間是提到在沿著流動通道的不同位置記錄的徑向擴(kuò)散測量。因此，一個第二測量點可以位于一個第一測量點的通道下游。另外的測量點可以位于也沿著該通道下游的位置。
[0036]在一個實施例中，在該方法中的步驟(i)提供一種包含一種或多種組分的組分流體流。因此，步驟(iv)包括在多個擴(kuò)散時間測量兩種或更多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴(kuò)散。
[0037]在一個實施例中，該組分流體流和該空白流體流是水流。
[0038]在一個實施例中，在步驟(ii)中提供兩個空白流，并且這些空白流被提供在大橫截面通道的組分流的一側(cè)，從而在步驟(iii)中在大橫截面通道中生成三個層流。
[0039]在一個實施例中，該方法進(jìn)一步包括步驟(V)，其中一種組分的一個擴(kuò)散系數(shù)值是由步驟(iv)的徑向擴(kuò)散測量值確定的，并且任選地流體動力學(xué)半徑是由擴(kuò)散系數(shù)值確定的。
[0040]在一個實施方案中，步驟(V)包括比較來自步驟(iv)的一種或多種組分的測量的徑向擴(kuò)散曲線與具有已知流體動力學(xué)半徑的組分的一系列分布，從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學(xué)半徑。
[0041]在一個實施方案中，步驟(V)包括使用關(guān)于具有已知流體動力學(xué)半徑的組分的一系列分布的一種最高熵正規(guī)化方法，使來自步驟(iV)的一種或多種組分的測量的徑向擴(kuò)散曲線去卷積，從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學(xué)半徑。在此實施例中，可以使用一種最小平方分析。具有已知流體動力學(xué)半徑的組分的該系列分布可以是一系列預(yù)測的分布。
[0042]在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種確定包含多種組分的一個流體的組成的方法，該方法包括以下步驟:
[0043](i)提供包含該多種組分的該流體的一個或多個測量的擴(kuò)散曲線；
[0044](ii)提供具有已知流體動力學(xué)半徑的組分的一系列預(yù)測的分布；以及
[0045](iii)使用關(guān)于具有已知流體動力學(xué)半徑的組分的該系列分布的一種最高熵正規(guī)化方法，使該一種或多種組分的測量的徑向擴(kuò)散曲線去卷積，從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學(xué)半徑。
[0046]在一個實施例中，確定一個流體的組成的方法提供基于該流體中每種組分的流體動力學(xué)半徑的一個組成曲線。
[0047]在步驟(i)中的測量的擴(kuò)散曲線可以是通過根據(jù)本發(fā)明的第一方面或第三方面的一種方法獲得或可獲得的。
[0048]在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種用于分析包含一種或多種組分的一個流體中的組成改變的方法，該方法包括以下步驟:在一個第一時間從該流體中獲取一種第一樣品并且根據(jù)本發(fā)明的第一方面或第三方面進(jìn)行一個分析，從而確定該流體在該第一時間的組成；以及在該第一時間之后的一個第二時間從該流體獲取一個第二樣品并且根據(jù)本發(fā)明的第一方面或第三方面進(jìn)行一個分析，從而確定該流體在該第二時間的組成。
[0049]該方法可以包括在隨后的時間獲取另外的、如第三樣品和第四樣品并且根據(jù)第一方面或第三方面進(jìn)行一個分析。
[0050]該方法允許生成有待檢測的組分的聚集物并且允許分離有待檢測的組分。反應(yīng)速度可以是由這些結(jié)果確定。
[0051]本發(fā)明的其他方面和本發(fā)明的不同實施例為如在此所述的。
【附圖說明】
[0052]圖1a是根據(jù)應(yīng)用的本發(fā)明的一個實施例的一個射流裝置的一部分的示意圖，其中圖像顯示在噴嘴處的一個組分流體流的分布(在此情況下，是牛血清白蛋白和β乳球蛋白在水中的混合物)和在沿著測量通道(小橫截面通道)的和9_處的三個測量區(qū)域?？瞻琢?黑色)被提供在組分流(白色)的一側(cè)。
[0053]圖1b是圖1b的示意圖的平面圖。
[0054]圖2包括涉及使用具有25nm和10nm半徑的熒光標(biāo)記組分(膠質(zhì))的一種50:50混合物(按體積計是0.1% )校準(zhǔn)圖1的射流裝置的圖表。A:徑譜通過使用最大熵正規(guī)化記錄的分布數(shù)據(jù)的一種最小平方分析(底部光譜)生成，并且與這些膠質(zhì)中每一種的均質(zhì)溶液的徑譜(頂部光譜和從頂部光譜起的第二個光譜)相比較。在此還示出了由在三個測量點(底部光譜)與一個單一測量點(從底部光譜起的第二個光譜)下記錄的數(shù)據(jù)生成的徑譜之間的比較。使用多個測量點提供了具有較大準(zhǔn)確度和較大分辨率的分辨譜。B:組分混合物在沿著該通道的和9mm處的三個不同測量點的分布以及對于通過最小平方算法生成的這些分布的擬合。
[0055]圖3示出了在120分鐘內(nèi)由單體生長的的Αβ (1-42)聚集物的大小分布。A:隨著時間的ThT熒光強度-在O分鐘時(在任何聚集之前)、在30和50分鐘時(在生長期之前和期間)、以及在單體已耗盡之后的120分鐘內(nèi)獲取等份樣品。B:大小分布發(fā)現(xiàn)使用以最大熵正規(guī)化擬合的最小平方。溶液最初是單體，在形成低聚物、原纖維以及最終的宏觀原纖維“叢”之前。
[0056]圖4示出了接頭，該接頭是其中一個組分流體流(白色)在三個不同的噴嘴或大橫截面通道中遇到兩個空白流體流(黑色)的點，這些噴嘴或通道從左開始具有300 μπκ1，000 ym和3，000 μ m的寬度，其中該寬度是指該噴嘴中的最大橫截面，該寬度比在接頭處的組流體流的寬度(即，具有30μπι、100μπι和300 μπι的寬度)寬十倍。大橫截面通道允許建立一個清潔且限定的組分流，它在接頭處具有一個減小的滯留時間(減小的停滯)。流速是4 μ LtT1并且組分是一種25nm膠質(zhì)。
[0057]圖5示出了微流體擴(kuò)散光譜法的分辨率的數(shù)值評估，其中(A)是當(dāng)用不同水平的隨機噪聲分辨的一種單一物質(zhì)時在一個單峰的位置上的分?jǐn)?shù)誤差，并且(B)是在不同水平的隨機噪聲下分辨兩種物質(zhì)之前這兩種物質(zhì)之間的最小分?jǐn)?shù)差分。
[0058]圖6示出了在個別均質(zhì)溶液中的A(胰高血糖素)、Β(β乳球蛋白)、以及C(BSA)和作為所有三種物質(zhì)的1:1:1混合物的D的大小分布，表示為流體動力學(xué)半徑。在365nm下使用一個倒置顯微鏡上的LED光源照射樣品并且使用一個高量子產(chǎn)率CXD照相機檢測這些樣品。一個樣品的穩(wěn)態(tài)分布的測量的持續(xù)時間是10s。在出口處的總流速是40 μ Lh'
[0059]圖7示出了 BSA在pH 7緩沖液的溶液和在80 % DMSO的溶液中的流體動力學(xué)半徑，如通過本發(fā)明的一種方法測定的。
[0060]圖8示出了(a)純化的α B-晶狀體蛋白的SDS-PAGE分析。與在變性條件下出現(xiàn)的大約20kDa相對應(yīng)的條帶與純的單體α B-晶狀體蛋白的預(yù)期分子質(zhì)量20，159Da 一致；并且示出(b)未處理的和OPA-標(biāo)記的α B-晶狀體蛋白的MALD1-MS分析。在OPA-標(biāo)記時出現(xiàn)的m/z-位移與大約2，200Da相對應(yīng)?？紤]到每個標(biāo)簽修飾增加176Da質(zhì)量，這些結(jié)果表明完全標(biāo)記每個α B-晶狀體蛋白分子的11個胺(10個伯胺和N-末端胺)。
[0061]圖9示出了(a) 30uMa B-晶狀體蛋白在本發(fā)明的射流儀器中的擴(kuò)散曲線。對于在
1、3和9cm處的三個測量點的擴(kuò)散曲線描繪熒光強度對比通道位置的實驗數(shù)據(jù)(實線)和相關(guān)擬合(虛線)，其中在90 μπι通道位置從頂部到底部的曲線與1、3和9cm曲線測量值相對應(yīng)。并且示出了(b)30uMaB-晶狀體蛋白的大小分布。兩個群體代表單體和低聚體a B-晶狀體蛋白。
[0062]圖10示出了用DLS (暗線)和本發(fā)明的微流體裝置(淺線)測量的30 μ M a B-晶狀體蛋白的大小分布。擴(kuò)散光譜法允許檢測低大小的物質(zhì)(約2nm)和低聚體物質(zhì)(約6nm)。DLS專門揭示了反映a B-晶狀體蛋白的低聚體形式的一個廣泛大小分布峰(中心在約Snm處)。
[0063]圖11示出了(a)使用α B-晶狀體蛋白的一個蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位實驗的電流跟蹤。在一個負(fù)電壓-500mV下使用50kHz貝塞爾濾波器進(jìn)行這些實驗；并且示出了(b)顯示轉(zhuǎn)位實驗中的平均事件電流與事件持續(xù)時間之間的關(guān)系的一個二維散點圖。事件的頻率是通過側(cè)面標(biāo)度所示的陰影表示的。
[0064]圖12 示出了在(a) 15 μΜ、(b)30yM、(c) 50 μ M、以及(d) 125 μ M 單體蛋白質(zhì)濃度下的α B-晶狀體蛋白的大小分布，如通過根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)散光譜法測量的。
[0065]圖13示出了脂質(zhì)體的大小分布，如通過根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)散光譜法測量的，其中這些脂質(zhì)體具有(a)15nm和(c)50nm擠出半徑和(e) 二者的一個1:1混合物。各個曲線表示在沿著擴(kuò)散通道(在1、3和9cm處，其中在90 μπι通道位置上從頂部到底部的曲線與1、3和9cm曲線測量相對應(yīng))的不同測量點的擴(kuò)散。對于所有三個測量點，穿過微型通道的熒光強度曲線(虛線)與對應(yīng)最小平方擬合(實線)一起描繪。具有(b)15nm和(d)50nm擠出半徑的脂質(zhì)體和(f) 二者的一個1:1混合物的大小分布，如使用DLS (暗線)和微流體擴(kuò)散(淡線)測量的。在大約4nm處的峰與游離的標(biāo)記的脂質(zhì)相對應(yīng)。僅擴(kuò)散光譜測量值確定此物質(zhì)。
【具體實施方式】
[0066]本發(fā)明提供一種用于分析一種組分從一個流體流中擴(kuò)散到另一個流體流中的方法。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)對于一個標(biāo)準(zhǔn)T型接頭流裝置的改變允許以較大準(zhǔn)確度測量該組分的擴(kuò)散。具體地說，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)流體在接頭處接觸時使它們的停滯最小化或消除該停滯的一種方式。
[0067]如在此所述的，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在其中組分和空白流接觸的接頭處使用一個大橫截面通道使流體停滯對擴(kuò)散分析的有害影響最小化。如以下所述的，大橫截面通道可以是在例如比下游通道寬度更寬十倍的區(qū)域中，其中進(jìn)行擴(kuò)散測量。本發(fā)明人已確定一個大橫截面通道在接頭處提供一個清潔且限定的組分流。因此，本發(fā)明人已將一個大橫截面通道引入用于測量組分?jǐn)U散的一個射流裝置中。在大橫截面通道下游是一個小橫截面通道，該小橫截面通道是檢測通道。
[0068]使用一個大橫截面通道被認(rèn)為提高多種益處。首先，其中建立流的區(qū)域由于對于一個給定的流速(flow rate)相對更低的流動速度(flow velocity)而縮短。第二，由于接頭到小流動通道的相對大小減小，較小比例的組分進(jìn)入零級流動區(qū)域。第三，擴(kuò)散相對于通道寬度w的凈效應(yīng)減小，因為速率尺度是I/ V w并且因此擴(kuò)散距離是V Wo
[0069]這些效應(yīng)的結(jié)果將在組分流和空白流進(jìn)入小橫截面通道時，提供用于組分流中的組分的良好限定的初始構(gòu)型。因此，使用一個大流動通道是在例如小寬度通道下游的通道中建立一個恒定速率曲線之前使顆粒擴(kuò)散最小化的一種有效方式，在該小寬度通道中進(jìn)行擴(kuò)散測量。
[0070]本發(fā)明的方法包括測量組分從一個組分流到一個相鄰空白流中的徑向擴(kuò)散的步驟。從這些測量中，最終可以測量