一種鉛-IgE螯合物及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設及檢測領(lǐng)域，更具體地說，設及一種鉛-I班馨合物及其制備方法和應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] I班主要由粘膜相關(guān)淋己樣組織產(chǎn)生，其中大部分是由胃腸淋己樣組織所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜組織合成。哺乳期產(chǎn)婦腺組織含有大量I班產(chǎn)生細胞， 該些細胞主要來自胃腸。在人類，還有少量的I班來自骨髓。人出生后4~6月開始合成 I班，4~12歲血清中含量達成人水平，血清型I班總Ig的10%左右，半衰期約5~6天。 I班有I班1和I班2兩個亞類。I班1主要存在于血清中，約占血清中I班的85%，a1鏈分 子量為56kD;1班2主要存在于外分泌液中，少部分W血清型I班存在，約占血清中I班的 15%，a2鏈缺乏較鏈區(qū)，分子量為52kD。血清中的I班除單體形式外還有由J鏈共價相連 的二聚體或=聚體等形式。分泌型I班是由J連接的雙體和分泌成分所組成，主要存在于 初乳、唾液、淚液、胃腸液、支氣管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型I班通過與相應的病原微生物（如脊髓灰質(zhì)炎病毒）結(jié)合，阻抑其吸附到易感細胞上，分 泌型I班還可中和毒素如霍亂弧菌毒素和大腸桿毒素等。新生兒易患呼吸道、胃腸道感染 可能與I班合成不足有關(guān)。慢性支氣管炎發(fā)作與分泌型I班的減少也有一定關(guān)系。產(chǎn)婦可 通過初乳將分泌型I班傳遞給嬰兒，該也是一種重要的自然被動免疫。嗜酸性粒細胞、中性 粒細胞和巨瞻細胞表達化aR，血清型單體I班可介導調(diào)理吞瞻和ADCC作用。此外，分泌 型I班具有免疫排除功能，即分泌型I班結(jié)合飲食中大量的可溶性抗原W及腸道正常菌群 或病原微生物所釋放的熱原物質(zhì)，防止它們進入血液。
[0003] 眾所周知，鉛（Pbckel，Pb)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必 需的微量元素，其存在于多種氨化酶中，催化氨的氧化還原反應，參與多種酶蛋白的合成和 細胞激素及色素的代謝，具有促進鐵的吸收和紅細胞的增長、激活酶形成輔酶、增強膜島 素、降血糖、保護屯、血管等作用，因此如果人體缺乏鉛，會導致疾病的發(fā)生。但是，事實在生 活中，由于環(huán)境污染，人體內(nèi)很少缺乏鉛，相反鉛的含量常常過量，常常導致疾病的發(fā)生，甚 至危及生命。
[0004] 鉛在體內(nèi)的含量超過一定水平就會對健康引起難W恢復的損害，它可W鉛煙，鉛 塵和各種氧化物形式被人體經(jīng)呼吸道和消化道攝入體內(nèi)，通過與巧離子的競爭作用，氧化 損傷，細胞調(diào)亡等機制，引起W神經(jīng)、消化、造血系統(tǒng)障礙為主的全身性、漸進性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害還可能遺傳到下一代。貧血是鉛中毒的早期癥狀之一，鉛可抑制血 紅素合成過程中許多酶的活性。鉛中毒可致血管疫李、腹絞痛、視網(wǎng)膜小動脈疫李和高血 壓，時常導致細小動脈硬化。鉛的腎損害常表現(xiàn)為間質(zhì)性腎炎或萎縮性腎炎等病變，腎小管 重吸收功能下降是早期的癥狀。鉛接觸還可能影響生殖功能，接觸鉛的女性發(fā)生不孕癥、流 產(chǎn)及死胎的機率增多，并可通過胎盤轉(zhuǎn)移到胎兒身上。經(jīng)口鉛中毒者肝臟為主要受損器官 之一，可引起肝腫大呈現(xiàn)黃痘，甚至肝硬變或肝壞死，肝損害可能是肝內(nèi)小動脈疫李引起 局部缺血所致。鉛引起化咐代謝障礙、抑制含琉基酶，干擾植物神經(jīng)。
[000引鉛與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密化可W與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鉛毒性研究的深入，人們逐漸認識到鉛與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認為是了解鉛的毒性機理的關(guān)鍵所在，因此，對鉛和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉛與蛋白質(zhì)作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鉛之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強對于鉛與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對鉛污染嚴重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉛-I班馨合物及其制備方 法，并建立鉛-I班馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測鉛-I班馨合物在評價一個 地區(qū)鉛污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鉛-I班馨合物可W間接反映 該個地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)鉛污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是；提供一種鉛-I班馨合物，鉛離子與 I班通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鉛-I班馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0009] A)鉛與I班的馨合反應：在提純源于人體的I班或按照生物學方法重組的I班中 加入鉛離子進行馨合反應，得到反應溶液；
[0010] B)純化鉛-I班馨合物的提?。徊捎妹庖哂H和層析法，去除反應溶液中未反應的 I班W及多余的鉛離子，即得鉛-I班馨合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下；
[0012] (1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水使鉛-I班馨合物 復溶；
[001引似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與I班特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] 做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，I班與 填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I;
[0016] (5)收集；收集洗脫液I;
[0017] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉛特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II;
[0021] (10)收集；收集洗脫液II;
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鉛-I班馨合物。
[0023] 其中，上述鉛-I班馨合物的制備方法，還包括步驟C);對鉛-I班馨合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下：
[0025] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[002引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鉛-I班馨合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] 做電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0028] (4)檢測；在膠床上找出含鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鉛W及檢測鉛的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉛-I班馨合物在制備檢測人體內(nèi)鉛-I班馨合物的試 劑或試劑盒中的應用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉛-I班馨合物作為標準品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲I班的物質(zhì)或捕獲鉛的物 質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鉛-I班馨合物的方法，W已知含量的上述的鉛-I班 馨合物作為標準品，采用W下方法之一對樣品進行檢測；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉛-I班馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純鉛-I班馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鉛-I班馨合物與電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實施本發(fā)明的鉛-I班馨合物及其制備方法和應用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成鉛-I班馨合物；
[00巧]2.本發(fā)明首次提出鉛-I班馨合物可用于制備檢測血樣中鉛-I班馨合物的試劑或 試劑盒中的應用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了鉛-I班馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測鉛-I班馨合 物在評價一個地區(qū)鉛污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鉛-I班馨合物 可W間接反映該個地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)鉛污染程度。本發(fā)明 建立的鉛-I班馨合物定量檢測方法其準確度大大提高，并且使檢測的重復性得到大大提 局。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明所述的鉛-I班馨合物的非變性電泳條帶圖；
[003引圖2為本發(fā)明所述的鉛-I班馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面，結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0040] 本發(fā)明除特別說明外，設及的實驗操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0041] 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊〇4溶液或0. 5-lmol/L化2冊〇4溶液；
[0042] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0044] 捕獲I班的物質(zhì)購買自艾美捷科技有限公司的型號為Abeam油171396的兔 Anti-I班抗體；其中，本發(fā)明所述與I班特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗I班抗體、抗I班抗體均為 捕獲I班的物質(zhì)；
[0045] 捕獲鉛的物質(zhì)為己傲得生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為AP7019的抗鉛抗體；其 中，本發(fā)明所述與鉛特異性結(jié)合的物質(zhì)、化抗、抗化抗體、抗鉛抗體均為捕獲鉛的物質(zhì)；
[0046] 酶標抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標記的抗體中的一種；
[0047] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0048] 洗漆液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2冊〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C