凈化的β-(1,3)-D-葡聚糖的制備方法
【專利說明】
[0001] 本申請是于2010年5月5日進(jìn)入中國，中國申請?zhí)枮?00880114327. 4,發(fā)明名稱 為"凈化的β _(1，3)-D-葡聚糖的制備方法"的PCT申請（國際【申請?zhí)枴縋CT/EP2008/007236) 的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種用于制備凈化的β _(1，3)-D-葡聚糖的方法，其包括下面的關(guān)鍵 步驟：堿化β _(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液來降低該溶液的粘度，過濾該低粘度溶液和通 過酸化來恢復(fù)初始粘度，并且加熱所獲得的含有β - (1，3)-D-葡聚糖的濾液。
【背景技術(shù)】
[0003] 分類為β-α，3)-D-葡聚糖的多糖種類的特征在于以β_(1，3)形式連接的D-葡 萄糖殘基主鏈，其中不同的e-(l，3)-D-葡聚糖在它們的側(cè)基和分子量方面的結(jié)構(gòu)是彼此 不同的。例如凝膠多糖完全由e-(l，3)-D-葡萄糖主鏈組成，而裂褶多糖，硬葡聚糖和酵母 葡聚糖包含β-(1，6)-糖基側(cè)鏈。由于它們強(qiáng)的增稠性能和獨特的流變性能，這些多糖已 經(jīng)獲得了諸多的工業(yè)應(yīng)用，特別是在人類食品或者動物飼料領(lǐng)域中，作為化妝品，水彩畫， 印刷油墨的成分，以及用在石油工業(yè)中，例如在鉆探泥漿，隔離液中，和作為瀝青乳液的穩(wěn) 定劑。
[0004] β _(1，3)-D-葡聚糖類型的多糖通常是通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)的，并且該發(fā)酵 液通常是直接使用和以稀釋形式使用的，通常是在巴氏滅菌之后使用（參見例如US專利 3301848)。但是，對于某些應(yīng)用而言，需要更高純度的f3-(l，3)-D-葡聚糖，其應(yīng)當(dāng)不包含 微生物細(xì)胞和/或該發(fā)酵液的其他水溶性成分。
[0005] 在這種情況中，通常使用沉淀方法，其包括加入水溶性有機(jī)溶劑（典型的是 異丙醇）或者另外一種沉淀劑例如聚乙二醇，來沉淀e-(i，3)-D-葡聚糖（參見例如 EP0266163A2和US3301848)。在沉淀后，將沉淀物與含水介質(zhì)經(jīng)由過濾器分離，或更優(yōu)選， 經(jīng)由離心分離進(jìn)行分離。所形成的沉淀物或者"凝結(jié)物"然后可以加壓來除去盡可能多的 其中所含的液體，然后可以干燥和研磨成為β _(1，3)-D-葡聚糖粉末，如本領(lǐng)域已知的那 樣（參見例如 US5224988 和 US3301848)。
[0006] 但是，雖然β_(1，3)-D-葡聚糖直接由發(fā)酵液中沉淀會提供良好的回收產(chǎn)率， 但是所獲得的沉淀物混有微生物細(xì)胞，并且因此不能用于某些應(yīng)用。所以，期望的是使 β _(1，3)-D_葡聚糖從無細(xì)胞的溶液中開始沉淀，該溶液可以通過任何便利的技術(shù)例如過 濾或者離心分離來獲得。
[0007] -種特別有利的將f3-(l，3)_D-葡聚糖與發(fā)酵液的其他成分，特別是微生物細(xì)胞 進(jìn)行分離的技術(shù)是過濾。但是，目前的對含有0-(l，3)_D-葡聚糖的溶液的過濾技術(shù)具 有這樣的缺點，即，這樣的溶液太粘稠而不能容易的進(jìn)行過濾（參見例如EP0266163A2和 US3301848)。具體的，該高的粘度會導(dǎo)致過濾壓力的升高或者過濾器的完全堵塞。為此原 因，目前的方法包括在過濾之前，為了降低粘度，用大量的溶劑來稀釋含有β - (1，3)-D-葡 聚糖的溶液的步驟。結(jié)果，該常規(guī)的方法在生產(chǎn)率和生產(chǎn)成本方面是不令人滿意的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明因此的目標(biāo)是提供一種用于制備凈化的β _(1，3)-D-葡聚糖的方法，其提 供了高的產(chǎn)率，并且是比現(xiàn)有的β_(1，3)-D_葡聚糖制備方法更加成本有效的。
[0009] 已經(jīng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)這個問題是通過所要求保護(hù)的方法來解決的，該方法包括下 面的關(guān)鍵步驟：通過加入堿來堿化β -(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液，以產(chǎn)生不太粘稠的溶 液，過濾該低粘度溶液，和使用酸來酸化所獲得的濾液，來恢復(fù)初始粘度，并且加熱所形成 的酸性β -(1，3)-D-葡聚糖溶液。
[0010] 本發(fā)明的方法能夠過濾未稀釋的β _(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液，該溶液包含高 濃度的β _(1，3)-D-葡聚糖，該濃度遠(yuǎn)高于能夠用于常規(guī)方法中的溶液的濃度，同時最終 所獲得的0-(l，3)-D-葡聚糖的粘度類似于常規(guī)方法的粘度。因此，本發(fā)明的方法表現(xiàn)出 明顯提高的加工生產(chǎn)率。另外，不需要或者僅僅需要有限量的試劑來稀釋待過濾的溶液。結(jié) 果，本發(fā)明的方法是比常規(guī)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)更成本有效的。
[0011] 更具體的，本發(fā)明的方法包括下面的步驟： (a) 提供pH高于11. 0的β - (1，3)-D-葡聚糖的初始水溶液； (b) 過濾該β -(1，3)-D-葡聚糖初始水溶液來獲得含有β -(1，3)-D-葡聚糖的濾液； (c) 用酸將該含有β - (1，3)-D-葡聚糖的濾液的pH調(diào)整為低于5. 0的pH，來獲得酸性 β_(1，3)-D-葡聚糖溶液； (d) 將該酸性f3-(l，3)-D-葡聚糖溶液加熱到60-160°C的溫度的范圍。
[0012] 本發(fā)明方法的步驟（a)中所提供的β -(1，3)-D-葡聚糖初始溶液可以是任何含有 0-(l，3)-D-葡聚糖的水溶液。該f3-(l，3)-D-葡聚糖可以以下面的高濃度包含在初始溶 液中：5g/l或者更高，特別是10g/l或者20g/l或者更高，高到這樣的高濃度例如40或者 50g/l或者仍然更高的濃度。典型的，該初始溶液是發(fā)酵液，未精制的β_(1，3)-D-葡聚糖 或者任何其他未精制的β _(1，3)-D-葡聚糖制劑的再生溶液。這些初始β -(1，3)-D-葡聚 糖溶液可以任選的包含少量的，優(yōu)選0-10重量％，更優(yōu)選0-5重量％的混合的另外的物質(zhì)， 例如鹽，表面活性劑，絡(luò)合劑等等。
[0013] 本發(fā)明的"發(fā)酵液"是任何的溶液，該溶液是通過具有產(chǎn)生β _(1，3)-D-葡聚糖的 能力的微生物的作用，在介質(zhì)例如基于糖和無機(jī)鹽的介質(zhì)的發(fā)酵之后獲得的。發(fā)酵液因此 包含用于發(fā)酵的微生物，未發(fā)酵的發(fā)酵介質(zhì)和發(fā)酵代謝物等等。在本發(fā)明含義中的發(fā)酵液 可以進(jìn)一步是這樣一種發(fā)酵液，其在過濾之前已經(jīng)進(jìn)行了滅菌或者巴氏滅菌。用于發(fā)酵的 微生物可以是細(xì)菌，真菌和藻類。發(fā)酵是如本領(lǐng)域已知的那樣來進(jìn)行的，并且描述在例如 US3301848 中。
[0014] 當(dāng)在此使用時，"未精制的f3-(l，3)_D-葡聚糖"的"再生溶液"包含任何這樣的 溶液，該溶液能夠通過將未精制的β - (1，3) -D-葡聚糖粉末溶解在合適的溶劑例如水中而 獲得的。術(shù)語"未精制的e-(l，3)-D-葡聚糖"目的是表示液體或者更典型的固體形式的 β _(1，3)-D-葡聚糖制劑，其包含微生物細(xì)胞或者至少其碎片。其例子包括干燥的或者醇 處理過的發(fā)酵液。該干燥的發(fā)酵液通常是粉末形式的，并且通常包含大約5-60重量％的 β-(1，3)-D-葡聚糖，其中其余部分基本上由細(xì)胞和剩余的少量的水組成。
[0015] 用于本發(fā)明中的β-(1，3)-D-葡聚糖包括分類為β-(1，3)-D-葡聚糖的任何多 糖，即，具有β-(1，3)-連接的D-葡萄糖殘基主鏈的任何多糖。這樣的f3-(l，3)-D-葡 聚糖的例子包括凝膠多糖（一種由例如土壤桿真菌屬物種5/7/7.)產(chǎn)生 的β-(1，3)_連接的D-葡萄糖殘基的均聚物），灰樹花多糖（一種由例如真菌fri/bh /roflt/iosa所產(chǎn)生的支化的|3-(1，3)-D-葡聚糖），香葫多糖（一種在β-(1，3)-主鏈的 每個第五葡萄糖殘基上連接有兩個葡萄糖接枝的支化的β _(1，3)-D-葡聚糖，其例如是 由真菌埃杜香葫eeoofes)產(chǎn)生的），裂裙多糖（一種在β-(1，3)-主鏈的每個 第三葡萄糖殘基上具有一個葡萄糖接枝的支化的β _(1，3)-D_葡聚糖，其例如是由群交 裂裙真菌產(chǎn)生的），硬葡聚糖（一種例如由真菌小核菌屬物種 (5Weroii應(yīng)卿.）所產(chǎn)生的支化的i3-(l，3)-D-葡聚糖，其來自β-(1，3)-主鏈的三個葡 萄糖分子中的一個葡萄糖分子通過（1，6)-β鍵連接到側(cè)鏈D-葡萄糖單元上），SSG (-種 例如由真菌油菜核盤菌sHeroiioriffl?)所產(chǎn)生的高度支化的β-(1，3)-葡 聚糖），來自酵母的可溶性葡聚糖（一種帶有β-(1，6)-連接側(cè)基的β-(1，3)-D-葡聚糖， 其例如是由啤酒糖酵母cererisiae)產(chǎn)生的），和海帶多糖（一種帶有 0-(1，3)-葡聚糖和0-(1，6)-葡聚糖側(cè)基的0-(1，3)-葡聚糖，其由例如褐藻類掌狀昆布 (the brown algae Laminaria digitatd) f11 H
[0016] 優(yōu)選用于本發(fā)明中的e-(i，3)-D-葡聚糖不包含側(cè)基，例如凝膠多糖，或者經(jīng)由 β - (1，6)-連接鍵合到β - (1，3)-主鏈