一種利用ssr標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]種子是農(nóng)作物生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)資料，品種的真實(shí)性及純度與產(chǎn)業(yè)發(fā)展及農(nóng)民收益休戚相關(guān)。棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，黃河流域是我國(guó)第二大產(chǎn)棉區(qū)，該地區(qū)棉花種植以常規(guī)棉花品種為主，品種鑒定主要依賴于形態(tài)鑒定，受鑒定者經(jīng)驗(yàn)及環(huán)境影響較大，此夕卜，以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)構(gòu)建指紋庫的方法雖然鑒定結(jié)果可靠，但工作量較大，操作繁瑣，市場(chǎng)應(yīng)用有一定的局限性。因此，迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)品種純度和真實(shí)性的方法。本方法利用品種間多態(tài)性較高、擴(kuò)增帶型單一的SSR引物進(jìn)行檢測(cè)，待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子DNA等量混合，根據(jù)檢測(cè)精度要求，準(zhǔn)備10?20份重復(fù)，根據(jù)帶型的雜合度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從而確定品種的純度及與標(biāo)準(zhǔn)樣的匹配度，該方法簡(jiǎn)單易行，時(shí)效性高，適用于黃河流域常規(guī)棉花品種商業(yè)化開發(fā)過程中權(quán)的保護(hù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，旨在解決棉花新品種權(quán)保護(hù)及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)過程中品種鑒別及種子純度控制的問題。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，所述利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法包括以下步驟:
[0005]步驟一，利用生產(chǎn)的主推品種及育種骨干親本資源，對(duì)棉花微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，從中選擇擴(kuò)增帶型清晰、多態(tài)性高、帶型單一的SSR標(biāo)記組建引物庫；
[0006]步驟二，將待檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子混合，利用液氮研磨后裝入1.5ml離心管中，準(zhǔn)備10-20份重復(fù)；
[0007]步驟三，利用熱酚法提取DNA，紫外分光光度計(jì)定量后，稀釋到50ng/ul待用；
[0008]步驟四，利用步驟一的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10ul，內(nèi)含PCR緩沖液，1.5mmol/L MgCl2, 200 μ mol/L dNTPs，50ng 微衛(wèi)星引物和 50 ?10ng 模板 DNA，TaqDNA聚合酶IU ;反應(yīng)程序:先94°C變性3min ;然后35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)為94°C 30s, 56°C 30s，72°C 30s ;最后 72°C延伸 7min ；
[0009]步驟五，取2.5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5ul Loading Buffer混勻上樣，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳約2小時(shí)后硝酸銀染色；
[0010]步驟六，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型，根據(jù)公式:
[0011]R = n/(N+n) X 100% ；
[0012]R:待測(cè)樣品的純合度；n:純和帶型數(shù)；N:雜合帶型數(shù)；
[0013]計(jì)算品種的純合度。
[0014]進(jìn)一步，所述PAGE膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型為純合帶型或雜合帶型。
[0015]進(jìn)一步，所述PCR 緩沖液為 10mmol/L Tris-HCl, pH 8.3，50mmol/L KC1。
[0016]進(jìn)一步，所述1.5ul Loading Buffer 含 300mmol/L 的 EDTA PH 7.0，36% 的甘油，0.05%的二甲苯青，0.05%的溴酚藍(lán)。
[0017]進(jìn)一步，根據(jù)步驟六的結(jié)果確定品種的真實(shí)性和純度:
[0018]R彡95%，待測(cè)樣品為目標(biāo)品種，且純度非常好；
[0019]90%^ R < 95%,待測(cè)樣品為目標(biāo)品種，但有少量混雜；
[0020]80%^ R < 90%，待測(cè)樣品可能為目標(biāo)品種，但混雜嚴(yán)重；
[0021 ] R < 80%，待測(cè)樣品不是目標(biāo)品種或者混雜極為嚴(yán)重，生產(chǎn)上不建議使用。
[0022]本發(fā)明提供的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；直接以種子為檢測(cè)樣品，減少田間取樣過程；通過帶型的雜合與否進(jìn)行判斷，結(jié)果較為直觀、清楚。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，時(shí)效性高，適用于黃河流域常規(guī)棉花品種商業(yè)化開發(fā)過程中品種權(quán)的保護(hù)。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法流程圖；
[0024]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的PAGE膠檢測(cè)帶型示意圖；
[0025]圖中:A:C1+CK ；B:C2+CK。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]下面結(jié)合附圖1對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0028]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法包括以下步驟:
[0029]SlOl:篩選品種間多態(tài)性較高、擴(kuò)增帶型單一的SSR引物，要求帶型清晰、擴(kuò)增穩(wěn)定;
[0030]S102:將待檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子混合，根據(jù)檢測(cè)要求準(zhǔn)備10-20份重復(fù)；
[0031]S103:采用熱酚法提取種子DNA ；
[0032]S104:利用核心SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0033]S105:PAGE膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型(純合帶型或雜合帶型)；
[0034]S106:根據(jù)雜合帶型的比例確定品種的真實(shí)性和純度，雜合帶型低于10 V倩況下可認(rèn)為與對(duì)照品種相同。
[0035]本發(fā)明的實(shí)施例具體步驟如下:
[0036]步驟一，利用生產(chǎn)上的主推品種及育種骨干親本資源，對(duì)棉花微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(CMD,Cotton Microsatellite Database)進(jìn)行篩選，從中選擇擴(kuò)增帶型清晰、多態(tài)性高、帶型單一的SSR標(biāo)記組建引物庫；
[0037]步驟二，將待檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子混合，利用液氮研磨后裝入1.5ml離心管中，根據(jù)精度要求準(zhǔn)備10-20份重復(fù)；
[0038]步驟三，利用現(xiàn)有技術(shù)的熱酚法提取DNA，紫外分光光度計(jì)定量后，稀釋到50ng/ul待用；
[0039]步驟四，利用步驟一的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10ul，內(nèi)含PCR緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl)，1.5mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTPs，50ng微衛(wèi)星引物和50?10ng模板DNA，Taq DNA聚合酶1U。反應(yīng)程序:先94°C變性3min ;然后35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)為94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ;最后72°C延伸7min ；
[0040]步驟五，取2.5 μ I 擴(kuò)增產(chǎn)物加入 1.5ul Loading Buffer (含 300mmol/L 的 EDTAPH 7.0，36%的甘油，0.05%的二甲苯青，0.05%的溴酚藍(lán))混勻上樣，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳約2小時(shí)后硝酸銀染色。；
[0041 ] 步驟六，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型，根據(jù)公式
[0042]R = n/(N+n) X 100%
[0043]R:待測(cè)樣品的純合度；n:純和帶型數(shù)；N:雜合帶型數(shù)；
[0044]計(jì)算品種的純合度；
[0045]步驟七，根據(jù)步驟六的結(jié)果確定品種的真實(shí)性和純度:1)如果R多95%，待測(cè)樣品為目標(biāo)品種，且純度非常好；
[0046]2)如果R < 95%，待測(cè)樣品為目標(biāo)品種，但有少量混雜；
[0047]3)如果R < 90%，待測(cè)樣品可能為目標(biāo)品種，但混雜嚴(yán)重；
[0048]4)如果R < 80%，待測(cè)樣品不是目標(biāo)品種或者混雜極為嚴(yán)重，生產(chǎn)上不建議使用。
[0049]通過以下的具體應(yīng)用對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果做進(jìn)一步的說明:
[0050]發(fā)明人在長(zhǎng)期的棉花分子輔助育種實(shí)踐中，利用黃河流域主推品種及課題組骨干親本資源，對(duì)棉花微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(CMD，Cotton Microsatellite Database)進(jìn)行篩選，從中選擇擴(kuò)增帶型清晰、多態(tài)性高、帶型單一的23個(gè)SSR標(biāo)記組建引物庫。
[0051]對(duì)市場(chǎng)銷售的2種包裝魯棉研36號(hào)進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)，由于只是一般的檢測(cè)，選用4對(duì)引物，檢測(cè)10個(gè)重復(fù)。
[0052]將魯棉研36號(hào)(標(biāo)記為CK)與待測(cè)樣品(分別標(biāo)記為Cl和C2)種子單?；旌希瑴?zhǔn)備10個(gè)重復(fù)，利用現(xiàn)有技術(shù)中改進(jìn)的熱酚法提取DNA。用引物庫中的4對(duì)引物(DPL0431、NAU1269, JESPRO12, NAU2826)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后PAGE膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型，如圖2所示。
[0053]通過帶型統(tǒng)計(jì)可以發(fā)現(xiàn)，Cl與CK的一致性(純合度)為45%，因此Cl為不同于魯棉研36號(hào)的其它品種，C2與CK的一致性為93%，說明C2為魯棉研36號(hào)品種。
[0054]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，其特征在于，所述利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法包括以下步驟: 步驟一，利用生產(chǎn)上主推品種及育種骨干親本資源，對(duì)棉花微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，從中選擇擴(kuò)增帶型清晰、多態(tài)性高、帶型單一的SSR標(biāo)記組建引物庫； 步驟二，將待檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子混合，利用液氮研磨后裝入1.5ml離心管中，準(zhǔn)備10-20份重復(fù)； 步驟三，利用熱酚法提取DNA，紫外分光光度計(jì)定量后，稀釋到50ng/ul待用； 步驟四，利用步驟一的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10ul，內(nèi)含PCR緩沖液，1.5mmol/L MgCl2, 200 μ mol/L dNTPs，50ng微衛(wèi)星引物和 50 ?10ng模板DNA，Taq DNA 聚合酶IU ;反應(yīng)程序:先94°C變性3min ;然后35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)為94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ；最后72°C延伸7min ； 步驟五，取2.5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5ul Loading Buffer混勾上樣，8%非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳2小時(shí)后硝酸銀染色； 步驟六，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型，根據(jù)公式:R = n/(N+n) X 100% ； R:待測(cè)樣品的純合度；n:純和帶型數(shù)；N:雜合帶型數(shù)； 計(jì)算品種的純合度。2.如權(quán)利要求1所述的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，其特征在于，所述PAGE膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型為純合帶型或雜合帶型。3.如權(quán)利要求1所述的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，其特征在于，所述 PCR 緩沖液為 1mmoI/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl04.如權(quán)利要求1所述的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，其特征在于，所述 1.5ul Loading Buffer 含 300mmol/L 的 EDTA PH 7.0，36% 的甘油，(λ 05% 的二甲苯青，0.05%的溴酚藍(lán)。5.如權(quán)利要求1所述的利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，其特征在于，根據(jù)步驟六的結(jié)果確定品種的真實(shí)性和純度: R≥95%，待測(cè)樣品為目標(biāo)品種，且純度好； .90%^ R< 95%,待測(cè)樣品為目標(biāo)品種； .80 % R < 90 %,待測(cè)樣品可能為目標(biāo)品種； R < 80%，待測(cè)樣品不是目標(biāo)品種或者混雜極為嚴(yán)重。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用SSR標(biāo)記快速鑒定常規(guī)棉花品種真實(shí)性的方法，首先篩選品種間多態(tài)性較高、擴(kuò)增帶型單一的SSR引物；將待檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子混合，準(zhǔn)備10-20份重復(fù)；采用熱酚法提取種子DNA；利用核心SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PAGE膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型；根據(jù)雜合帶型的比例確定品種的真實(shí)性和純度。本發(fā)明利用品種間多態(tài)性較高、擴(kuò)增帶型單一的SSR引物進(jìn)行檢測(cè)，待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品單粒種子混合，提取DNA，準(zhǔn)備10～20份重復(fù)，PCR擴(kuò)增后PAGE膠檢測(cè)，根據(jù)帶型雜合度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定品種的純度及與標(biāo)準(zhǔn)樣的匹配度，方法簡(jiǎn)單易行，時(shí)效性高，適用于黃河流域常規(guī)棉花品種商業(yè)化開發(fā)過程中品種權(quán)的保護(hù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104962640
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510409202
【發(fā)明人】韓宗福, 孔凡金, 鄧永勝, 王宗文, 王景會(huì), 李汝忠
【申請(qǐng)人】山東棉花研究中心
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日