修飾植物中的糖蛋白產(chǎn)生的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00880103174. 3、發(fā)明名稱為"修飾植物中的糖蛋白產(chǎn)生"的申 請(qǐng)的分案申請(qǐng)，該母案申請(qǐng)是2008年6月13日提交的PCT申請(qǐng)PCT/CA2008/001139進(jìn)入 中國國家階段的申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供了具有經(jīng)修飾的糖蛋白 產(chǎn)生的植物。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 免疫球蛋白（IgG)是對(duì)多種性質(zhì)的特異性抗原對(duì)應(yīng)物具有特征性親和力的復(fù)合 異多亞基蛋白。目前，對(duì)IgG生產(chǎn)細(xì)胞系的常規(guī)分離和IgG定向進(jìn)化與分子工程技術(shù)的 出現(xiàn)極大地影響了它們作為生物治療劑和在一般生命科學(xué)市場(chǎng)中的發(fā)展。治療性單克隆 IgG(單克隆抗體，mAb)主宰著目前的新抗炎藥和抗癌藥市場(chǎng)，并且目前有數(shù)百種新的候選 者處于針對(duì)改進(jìn)應(yīng)用或新應(yīng)用的研宄和臨床開發(fā)中。每年的mAb市場(chǎng)需求從數(shù)克（診斷 學(xué)）、數(shù)千克（抗毒素）到多達(dá)一百或數(shù)百千克（生物防御、抗癌、抗感染、抗炎藥）。
[0005] 盡管CH0細(xì)胞培養(yǎng)物仍然是它們優(yōu)選的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)宿主，但目前公認(rèn)的是，為 了讓mAb在生命科學(xué)市場(chǎng)中完全發(fā)揮作用，必須開發(fā)替代性的生產(chǎn)系統(tǒng)，因?yàn)檫@些培養(yǎng)物 需要的設(shè)備不容易大規(guī)模調(diào)控，它們的建造和維護(hù)成本極高并且逐漸提高，而且其GMP認(rèn) 證在建設(shè)后仍然平均需要三年。即便是在早期開發(fā)階段，對(duì)具有可接受的產(chǎn)率和生產(chǎn)力的 CH0細(xì)胞系的選擇仍然是一個(gè)昂貴和長期的過程。會(huì)降低上游成本（更高的產(chǎn)率、更簡(jiǎn)單的 技術(shù)和基礎(chǔ)設(shè)施），具有更短的前導(dǎo)時(shí)間、在容量方面更加靈活而同時(shí)滿足現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)系 統(tǒng)目前的生產(chǎn)力、品質(zhì)和安全特性的新生產(chǎn)系統(tǒng)很可能在每個(gè)開發(fā)階段對(duì)用于生命科學(xué)市 場(chǎng)之mAb和疫苗的開發(fā)具有重大影響。
[0006] 對(duì)mAb和目前應(yīng)用于生命科學(xué)中的若干其他蛋白質(zhì)的生產(chǎn)而言，植物是合適的宿 主（近期綜述見Ko和Koprowski2005 ;Ma等，2005 ;Yusibov等，2006)。MAb已在穩(wěn)定的轉(zhuǎn) 基因植物株系中以多達(dá)200mg/kg鮮重（FW)的產(chǎn)量生產(chǎn)，并且通過瞬時(shí)表達(dá)以多達(dá)20mg/kg FW的產(chǎn)量生產(chǎn)（Kathuria，2002)。Giritch等（2006)報(bào)道了對(duì)IgG而言 200-300mg/kg葉 重量的表達(dá)水平，其中一個(gè)列舉的最大值為500mg/kg，其通過使用基于多病毒的瞬時(shí)表達(dá) 系統(tǒng)獲得。
[0007] 植物和哺乳動(dòng)物N-糖基化過程有差異。哺乳動(dòng)物中N-糖基化的較后步驟為向復(fù) 合聚糖上添加0 1，4半乳糖、a1，6巖藻糖（0 -1，4半乳糖、a-1，6巖藻糖）和末端唾液酸 殘基。然而在植物中添加的是0 1，3半乳糖、a1，3巖藻糖（0-1，3半乳糖、a-1，3巖藻 糖），a1，4巖藻糖和M，2木糖（a_1，4巖藻糖和0-1，2木糖）殘基。a1，3-巖藻糖和 0 1，2木糖是一些植物變應(yīng)原的糖表位組分，這些殘基被認(rèn)為可能是免疫原性的，并且不期 望它們出現(xiàn)在治療性蛋白質(zhì)（包括抗體）上。
[0008] 對(duì)肽的C端添加KDEL序列通常被用于確保肽從高爾基體上回收至ER。該方法 被用于使用煙草葉的農(nóng)桿菌滲入法生產(chǎn)非巖藻糖基化和非木糖基化的抗體（Sriraman等， 2004)。然而，所添加的KDEL肽可能是免疫原性的，并且該方法對(duì)于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的適 用性有限。
[0009] 還通過修飾巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和木糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)a1，3巖藻糖 (a-1，3巖藻糖）和|3 1，2木糖（0 _1，2木糖）添加的控制。在苔蘚（Physcomitrella patens;Koprivova等，2〇04)和擬南芥（Arabidopsisthaliana)(Strasser等，2〇04) 中產(chǎn)生了不能在復(fù)合聚糖上添加a1，3巖藻糖和M，2木糖的突變體。還通過在浮萍 (Lemnaminor)中表達(dá)革E1向al，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和0 1，2木糖木糖基轉(zhuǎn)移酶基因的干 擾RNA(RNAi)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和木糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的部分抑制（Cox等， 2004)。然而，這些酶活性的完全抑制對(duì)若干植物物種具有有害影響，因?yàn)樗鼈兏蓴_關(guān)鍵的 發(fā)育事件，例如花粉形成或結(jié)籽。RNAi誘導(dǎo)的mRNA特異性降解可能不是隨時(shí)間穩(wěn)定的，并 且可能不適合用于生產(chǎn)治療性藥物的多種基于植物的平臺(tái)，因?yàn)槠浔粓?bào)道為對(duì)環(huán)境因素敏 感。
[0010]W0 03/078637公開了人半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化植物聚糖上添加末端M，4半乳糖 (GalT)的用途。通過使用與木糖基轉(zhuǎn)移酶跨膜結(jié)構(gòu)域的融合物得到的GalT表達(dá)并將其活 性靶向順面高爾基體導(dǎo)致末端半乳糖的添加和帶有植物特異性殘基的N-聚糖的減少（還 見Bakker等，2006)。將這些植物與含有重組IgG的植物育種，導(dǎo)致含有巖藻糖和木糖的聚 糖的顯著但不定量的減少。
[0011] 通過N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III;EC2. 4. 1. 144)催化將0-1，4_連接 的N-乙酰葡糖胺（GlnNAc)殘基與0-連接的甘露糖結(jié)合，產(chǎn)生平分（bisected)的GlcNac。 已描述了將該酶引入植物中（Rouwendal等，2007)，并且植物表達(dá)的包含GnT-III的、具有 復(fù)合N-聚糖的蛋白質(zhì)被對(duì)切并帶有兩個(gè)GlnAc殘基。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明涉及修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供了具有經(jīng)修飾的糖蛋白 產(chǎn)生的植物。
[0014] 提供用于修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的改進(jìn)方法是本發(fā)明的一個(gè)目的。
[0015] 本文中提供了具有核苷酸序列（A)的核酸，所述核苷酸序列（A)包含SEQIDN0 : 17 (GNTl-GalT;圖5d)的1-1077位核苷酸，或包含與SEQIDNO: 17的1-1077位核苷酸顯 示約80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下參數(shù)測(cè)定：程序：blastn;數(shù) 據(jù)庫：nr;預(yù)期10 ;過濾：低復(fù)雜度；比對(duì)：成對(duì)；字長：11，其中所述核苷酸序列編碼修飾目 的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)。
[0016] 還提供了具有核苷酸序列（B)的核酸，所述核苷酸序列（B)包含第一核酸序列，所 述第一核酸序列包含SEQIDN0:14 (GalT)的5-1198位核苷酸，或包含與SEQIDN0:14的 5-1198位核苷酸顯示約80%到100%同一性的序列，所述同一性使用以下參數(shù)測(cè)定：程序： blastn;數(shù)據(jù)庫：nr;預(yù)期10 ;過濾：低復(fù)雜度；比對(duì)：成對(duì)；字長：11，其中所述第一核酸序 列編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)，所述第一核酸序列與包含35S啟動(dòng)子或質(zhì)體藍(lán)素 啟動(dòng)子的第二核酸序列有效連接。
[0017]本發(fā)明描述了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含SEQIDN0: 26(GNTl-GnT-III)的1-1641位核苷酸，或包含與SEQIDNO:26的1-1641位核苷酸顯示 約80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下參數(shù)測(cè)定：程序：blastn;數(shù)據(jù) 庫：nr;預(yù)期10 ;過濾：低復(fù)雜度；比對(duì)：成對(duì)；字長：11，其中所述核苷酸序列編碼修飾目的 蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)。
[0018] 還描述了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含第一核酸序列，所述 第一核酸序列包含SEQIDN0:16(GnT-III)的1-1460位核苷酸，或包含與SEQIDN0: 16的1-1460位核苷酸約80%到100%相似的序列，所述相似性使用以下參數(shù)測(cè)定：程序： blastn;數(shù)據(jù)庫：nr;預(yù)期10 ;過濾：低復(fù)雜度；比對(duì)：成對(duì)；字長：11，其中所述第一核酸序 列編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)，所述第一核酸序列與包含35S啟動(dòng)子或質(zhì)體藍(lán)素 啟動(dòng)子的第二核酸序列有效連接。
[0019] 還提供了包含上文所述（A)、(B)、（C)或（D)核苷酸序列的植物、植物細(xì)胞或種子。
[0020] 本發(fā)明還涉及雜合蛋白GNTl-GalT，其包含與0 _1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域 融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶CTS結(jié)構(gòu)域，并且包含序列SEQIDN0:18。SEQIDN0:18 的氨基酸序列可以由SEQIDNO:17的核苷酸序列編碼。還提供了包含上述雜合蛋白的植 物、植物細(xì)胞或種子。還提供了包含下述核酸的植物、植物細(xì)胞或種子，所述核酸包含核苷 酸序列SEQIDN0 :17。
[0021] 本發(fā)明包括雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移 酶III催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶CTS結(jié)構(gòu)域，并且包含氨基酸序列SEQID NO:20。SEQIDNO:21的氨基酸序列可以由核苷酸序列SEQIDNO:26編碼。還提供了包 含上述雜合蛋白的植物、植物細(xì)胞或種子。還提供了包含下述核酸的植物、植物細(xì)胞或種 子，所述核酸包含核苷酸序列SEQIDN0:26。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，提供了用于合成目的蛋白質(zhì)的方法（1)，包括在植物或植物部分中表 達(dá)編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋 白GNTl-GalT，所述雜合蛋白包含與0-1，4_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GalT)催化結(jié)構(gòu)域融合的 N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶（GNTl)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的 第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所 述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方法還包括表達(dá)所述第一和第二核苷酸序列， 從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖的目的蛋白質(zhì)。
[0023] 如上所述的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在植物中瞬時(shí)表達(dá)，或者它們 可以穩(wěn)定表達(dá)。另外，第一調(diào)節(jié)區(qū)可以是第一組織特異性啟動(dòng)子，第二調(diào)節(jié)區(qū)是第二組織特 異性啟動(dòng)子。第一和第二組織特異性啟動(dòng)子各自可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于合成目的蛋白質(zhì)的方法（2)。所述方法如上文所述（方法1)， 其中目的蛋白質(zhì)可以是抗體。如果目的蛋白質(zhì)是抗體，則編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序 列包含與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)2A有效連接的核苷酸序列2A，以及與在植物中有活性 的調(diào)節(jié)區(qū)2B有效連接的核苷酸序列2B，并且2A和2B各自編碼的產(chǎn)物組合產(chǎn)生抗體。調(diào)節(jié) 區(qū)2A可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)區(qū)2B可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。
[0025] 本發(fā)明還提供了如上所述的方法（1)或（2)，其中在植物中表達(dá)第三核苷酸序 列，所述第三核苷酸序列編碼沉默性抑制基因，與在植物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連 接。編碼沉默性抑制基因的第三核苷酸序列可以是例如HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、 TBSVpl9、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、 GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO。第三組織特異性啟動(dòng)子可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。
[0026] 本發(fā)明提供了用于驅(qū)動(dòng)目的蛋白質(zhì)在植物中表達(dá)的植物表達(dá)系統(tǒng)，其中所述目的 蛋白質(zhì)包含經(jīng)修飾的糖基化模式。例如，目的蛋白質(zhì)可包含減少的巖藻糖基化、木糖基化或 者巖藻糖基化和木糖基化都減少的N-聚糖。或者，目的蛋白質(zhì)可包含經(jīng)修飾的糖基化模 式，其中所述蛋白質(zhì)缺乏巖藻糖基化、木糖基化或者巖藻糖基化和木糖基化都缺乏的殘基， 并且顯示增加的半乳糖基化。另外，可以添加末端半乳糖，其導(dǎo)致與在野生型植物中產(chǎn)生的 相同目的蛋白質(zhì)相比減少或消除了目的蛋白質(zhì)的巖藻糖基化和木糖基化。
[0027] 本發(fā)明提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法（3)，包括 在植物、植物部分或植物細(xì)胞中共表達(dá)編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的核苷酸序 列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白包含與N-乙酰葡糖氨 基轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶（GNTl)CTS結(jié)構(gòu)域，所 述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編 碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方 法還包括共表達(dá)所述第一和第二核苷酸序列，從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的 聚糖的目的蛋白質(zhì)。
[0028] 上述（方法3)第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在植物中瞬時(shí)表達(dá)，或者它 們可以穩(wěn)定表達(dá)。另外，第一調(diào)節(jié)區(qū)可以是第一組織特異性啟動(dòng)子，第二調(diào)節(jié)區(qū)是第二組織 特異性啟動(dòng)子。第一和第二組織特異性啟動(dòng)子各自可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。
[0029] 還提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法（4)，包括在 植物、植物部分或植物細(xì)胞中共表達(dá)編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸 序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GalT，所述雜合蛋白包含與 0-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（6&11')催化結(jié)構(gòu)域融合的^乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶（6階'1)〇^結(jié)構(gòu) 域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸 序列編碼0_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào) 節(jié)區(qū)有效連接，所述第三核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第三核苷酸序列與在所述植物 中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方法還包括共表達(dá)所述第一、第二和第三核苷酸序列， 從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的聚糖的目的蛋白質(zhì)。
[0030] 如上文所述（4)的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在植物中瞬時(shí)表達(dá)，或 者它們可以穩(wěn)定表達(dá)。另外，第一調(diào)節(jié)區(qū)可以是第一組織特異性啟動(dòng)子，第二調(diào)節(jié)區(qū)是第二 組織特異性啟動(dòng)子。第一和第二組織特異性啟動(dòng)子各自可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。
[0031] 本發(fā)明描述了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法（5)，包 括在植物、植物部分或植物細(xì)胞中共表達(dá)編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核 苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白 包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶 (GNT1)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所 述第二核苷酸序列編碼N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III，所述第二核苷酸序列與在所述植物中 有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第三核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第三核苷酸序 列與在所述植物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方法還包括共表達(dá)所述第一、第二和 第三核苷酸序列，從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的聚糖的目的蛋白質(zhì)。
[0032] 上述方法（5)中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可以在 植物中瞬時(shí)表達(dá)，或者它們可以穩(wěn)定表達(dá)。另外，第一、第二和第三調(diào)節(jié)區(qū)可以是組織特異 性啟動(dòng)子。例如，組織特異性啟動(dòng)子各自可以是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子。
[0033] 根據(jù)本文所述的方法，可以因此以高產(chǎn)率生產(chǎn)缺乏下述聚糖的目的蛋白質(zhì)，所述 聚糖已知涉及超敏反應(yīng)，或者以其他方式涉及變態(tài)反應(yīng)。這通過共表達(dá)經(jīng)糖改造的酶和目 的蛋白質(zhì)來完成，這導(dǎo)致產(chǎn)生比野生型植物中所生產(chǎn)的免疫原性更低的蛋白質(zhì)。
[0034] 如本文所述，可以使用利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)化表達(dá)系統(tǒng)，然而， 本發(fā)明方法也可以與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)一起使用。本發(fā)明因此不限于瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。
[0035] 通過使用瞬時(shí)共表達(dá)，本文所述系統(tǒng)避免了過長的生產(chǎn)時(shí)間，以及優(yōu)良突變體或 經(jīng)糖改造的轉(zhuǎn)基因株系及其隨后作為親本株系用途的選擇過程（例如如Bakker，2005所 述）。其還避免了突變體或經(jīng)糖改造的植物在生產(chǎn)力、花粉生產(chǎn)、結(jié)籽（Bakker等2005)和 生存力（Boisson等，2005)方面通常遇到的其他問題。如本文中所述，目的蛋白質(zhì)與修飾性 嵌合人半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的共表達(dá)對(duì)生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)或產(chǎn)量沒有影響。
[0036] 本文所述的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生達(dá)到每千克葉鮮重1. 5g高品質(zhì)抗體的表達(dá)水平， 超過了使用其他表達(dá)系統(tǒng)的植物中針對(duì)任何抗體報(bào)道的累積水平，所述其他表達(dá)系統(tǒng)包括 基于多病毒的系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物。
[0037] 本文所述方法（例如涉及表達(dá)GalT或GalT-GNTl)也可以用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。 盡管顯示上文所述的許多優(yōu)點(diǎn)，但是本發(fā)明不限于瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。
[0038] 本發(fā)明的概述不必然描述本發(fā)明的所有特征。
[0039] 附圖簡(jiǎn)述
[0040] 通過以下的描述可以更明白本發(fā)明的這些特征和其他特征，所述描述參照附圖， 其中：
[0041] 圖1A展示了為了C5-1表達(dá)而裝配的基于質(zhì)體藍(lán)素的盒。R610包含編碼C5-1LC 和C5-1HC-KDEL的核苷酸序列；R612包含編碼C5-1LC和C5-1HC的核苷酸序列。C5-1LC: C5-1輕鏈編碼序列；C5-1HC:C5-1重鏈編碼序列。圖1B展示了質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5'UTR 的核苷酸序列（SEQIDN0 :23)，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)用粗體顯示，翻譯起始密碼子加有下劃線。圖1C 展示了質(zhì)體藍(lán)素3'UTR和終止子的核苷酸序列（SEQIDN0 :24)，終止密碼子加有下劃線。
[0042] 圖2展示了在用與或不與沉默性HcPro抑制基因共表達(dá)的R610和R612(基于質(zhì) 體藍(lán)素的表達(dá)盒）滲入的本生煙（Nicotianabenthamiana)葉中，C5-1抗體的累積。展示 的數(shù)值對(duì)應(yīng)于平均累積水平和標(biāo)準(zhǔn)差，其得自對(duì)3株植物（注射器）的6次測(cè)量，或?qū)s12 株植物（250g)的各個(gè)滲入批次的6次測(cè)量。
[0043] 圖3展示了注射器滲入和真空滲入植物的提取物中，C5-1累積的蛋白質(zhì)印跡分 析。圖3A展示了使用與過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)對(duì)來自用R612(用于分泌， 泳道1)或用R610(用于ER停留，泳道2)滲入之植物的提取物進(jìn)行的免疫印跡。C1:100ng 市售小鼠IgGl (Sigma M9269)，作為電泳迀移率的對(duì)照上樣；C2:12 y g從模擬滲入的生物量 中提取的總蛋白質(zhì)（空載體）。C3:與從模擬滲入的生物量中提取的12 yg總蛋白質(zhì)（空載 體）混合的l〇〇ng市售鼠IgGl (Sigma M9269)。圖3B展示了使用與過氧化物酶綴合的人 IgGl，對(duì)來自用R612(用于分泌，泳道1)或用R610(用于ER停留，泳道2)滲入之植物的提 取物進(jìn)行的活性免疫印跡。C1:從雜交瘤中純化的2 y g對(duì)照C5-1 (Khoudi等，1997) ;C2 :從 模擬滲入的生物量中提取的75 y g總蛋白質(zhì)（空載體）。
[0044] 圖4展示了抗體分析，所述抗體從用R612 (用于分泌，泳道1)或R610 (用于ER停 留，泳道2)滲入的植物中純化。圖4A展示了在非還原條件下進(jìn)行的粗提物和純化抗體的 SDS-PAGE。圖4B展示了在還原條件下進(jìn)行的純化抗體的SDS-PAGE。圖4C展示了用與過氧 化物酶綴合的人IgGl進(jìn)行的純化抗體的活性免疫印跡。圖4D展示了來自不同滲入批次的 6批次純化C5-1中污染物的比較。C:2. 5yg市售小鼠IgGl(SigmaM9269)，作為電泳迀移 率的對(duì)照上樣。
[0045] 圖5A展示了為表達(dá)天然（R622)和雜合（R621)形式半乳糖基轉(zhuǎn)移酶而裝配的 盒的代表性例子。GNTI-CTS:N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶I的CTS結(jié)構(gòu)域；GalT-Cat:M，4 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域；(R622的）GalT:人M，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。圖5B展示了 6&11'(耶?-6&1 :0 61〇似(^1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶多肽1，|3-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1)的核 苷酸序列（SEQIDNO:14)，ATG起點(diǎn)加有下劃線；跨膜結(jié)構(gòu)域加有下劃線并且為斜體；加粗 序列對(duì)應(yīng)于人M，4GalT的催化結(jié)構(gòu)域；FLAG表位為斜體。圖5C展示了GalT(UDP-Gal: 0 61(^(^1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶多肽1，0-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1)的氨基酸序列彼〇 IDN0 :15)?？缒そY(jié)構(gòu)域加有下劃線并且是斜體；加粗序列對(duì)應(yīng)于人M，4GalT的催化結(jié) 構(gòu)域；FLAG表位為斜體。圖?展示了GNTIGalT的核苷酸序列（SEQIDN0 :17)，其ATG起 點(diǎn)加有下劃線；跨膜結(jié)構(gòu)域（CTS)加有下劃線并且為斜體；粗體序列對(duì)應(yīng)于人M，4GalT 的催化結(jié)構(gòu)域；FLAG表位為斜體。圖5E展示了GNTIGalT的氨基酸序列（SEQIDNO:18)。 跨膜結(jié)構(gòu)域（CTS)加有下劃線并且為斜體；粗體序列對(duì)應(yīng)于人M，4GalT的催化結(jié)構(gòu)域； FLAG表位為斜體。圖5F展示了N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶（GNT1;SEQIDN0 :21)的CTS結(jié)構(gòu) 域（細(xì)胞質(zhì)尾，跨膜結(jié)構(gòu)域，莖區(qū)）。圖5G展示了CTS(SEQIDN0:22)的氨基酸。圖5H展 示了Gntl-GntIII(SEQIDN0:26)的核酸序列。圖 51 展示了Gntl-GntIII(SEQIDN0: 20)的氨基酸序列。圖5J展示了GntIII(SEQIDNO: 16)的核酸序列。圖5K展示了Gnt III(SEQIDNO: 19)的氨基酸序列。
[0046]圖6展示了從表達(dá)C5-1的植物中獲得的提取物的圖譜，其或者針對(duì)蛋白質(zhì)染色， 或者進(jìn)行Western分析。上圖顯示考馬斯藍(lán)染色的PAGE凝膠。上數(shù)第二幅圖顯示使用雞 冠刺桐（Erythrinacristagali)凝集素（ECA)的親和檢測(cè)（affinodetection)，所述凝集 素與M，4半乳糖特異性結(jié)合。上數(shù)第三幅圖顯示使用抗a1，3巖藻糖抗體的Western印 跡分析。底部圖顯示使用抗0 1，2木糖特異性抗體的Western印跡分析。R612 :單獨(dú)表達(dá) 的C5-1 ;R612+R622 :與GalT共表達(dá)的C5-1 (共滲入）；R612+R621 :與GNTl-GalT共表達(dá)的 C5-l〇
[0047] 圖7展示了MALDI-T0F質(zhì)譜，其用于測(cè)定C5-1的經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽 EEQFNSTFR(SEQIDN0:13)的N-糖基化，所述C5-1從帶有一系列構(gòu)建體的本生煙注射器滲 入植物中分離。在制備性HPLC上分離后測(cè)定糖肽的N-糖基化。在真空滲入后獲得類似的結(jié) 果。圖7A展示了在R612表達(dá)（C5-1，見圖1)后，經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。 圖7B展示了在與天然GalT(R622,見圖5) -起表達(dá)C5-1(R612,見圖1)后，經(jīng)胰蛋白酶消化 的糖肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖7C展示了與GNTIGalT(R621，見圖5) -起表達(dá)C5-1(R612,見 圖1)后，經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖7C插圖對(duì)應(yīng)于圖譜的m/z2650-2800 放大，展示在R612植物中檢測(cè)到主要復(fù)合離子J的缺失（箭頭）。A:GlcNAcMan3GlcNAc2; B:Man5GlcNAc2;C:
[0048] GalGlcNAcMan3GlcNAc2;D :GlcNAc 2Man3GlcNAc2;E :Man 6G1cNAc2;F:
[0049] GalGlcNAcMan3(Xyl)GlcNAc 2；G ：GlcNAcMan 5G1cNAc2；H：
[0050] GlcNAc2Man3(Fuc)GlcNAc 2；I ：Man 7GlcNAc2；J ：GlcNAc 2Man3(Xyl) (Fuc) GlcNAc2；
[0051] K:GalGlcNAcMan5GlcNAc2;L :Man 8G1cNAc2;M:Man 9G1cNAc2〇
[0052] 發(fā)明詳述
[0053] 本發(fā)明涉及修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供了具有修飾的糖蛋白產(chǎn)