專利名稱：產(chǎn)生新型、高度化學(xué)保護性的十字花科植物種質(zhì)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明是在美國政府的支持下、使用NIH撥款1PO1 CA44530完成，美國政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及產(chǎn)生新型、高度化學(xué)防護(chemoprotectant)的十字花科植物種質(zhì)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及產(chǎn)生新型、高度化學(xué)防護的嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì)的方法。本發(fā)明涉及產(chǎn)生含有顯著量化學(xué)保護性(chemoprotective)化合物的種質(zhì)，所述化學(xué)保護性化合物調(diào)節(jié)參與致癌劑代謝的哺乳動物酶。這些化合物誘導(dǎo)2相(Phase 2)酶的活性，而不誘導(dǎo)激活致癌劑的1相(Phase 1)酶的生物學(xué)顯著活性。更具體地說，所述新型種質(zhì)含有提高的烷基芥子油苷(alkylglucosinolate)/吲哚芥子油苷(indole glucosinolate)比例。
本發(fā)明還提供了在一定條件下萌發(fā)十字花科的種子和籽苗的方法，所述條件增加對抗一定范圍的人類病原體的抗生素活性并增加所述籽苗的化學(xué)防護活性。
2．相關(guān)技術(shù)的描述人們已經(jīng)普遍認識到，飲食對于控制發(fā)展中的癌癥的風(fēng)險起很大作用，并且增加水果和蔬菜的消費降低人類中的癌癥發(fā)生率。目前相信主要的保護機制依賴于植物中化學(xué)成分的存在，當將所述化學(xué)成分傳遞給哺乳動物細胞時，提高使致癌劑解毒的2相酶的水平。
2．相酶通過使在其它情況下會損傷DNA的親電子形式的致癌劑解毒而起作用。提高2相酶水平的化合物被命名為“選擇性誘導(dǎo)物”。2相酶的選擇性誘導(dǎo)物被稱為單功能誘導(dǎo)物。這意味著它們僅誘導(dǎo)2相酶，而不顯著誘導(dǎo)1相酶活性。與此相比，同時誘導(dǎo)2相酶和1相酶的化合物被稱為雙功能誘導(dǎo)物。(見Prochaska和Talalay(1988)Cancer Res.48:4776-4782)。單功能誘導(dǎo)物幾乎全是親電子試劑并屬于至少9個不同的化學(xué)類別。(見Prestera等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2963-2969；Khachick等(1999),ANTIOXIDANT FOODSUPPLEMENTS IN HUMAN HEALTH,Packer,L.等(編輯)第203-229頁，Academic Press,San Diego)。幾乎所有這些誘導(dǎo)物所共同擁有的唯一明顯的共同特性是它們與硫羥基反應(yīng)的能力。
因此，單功能誘導(dǎo)物是降低哺乳動物對致癌劑的毒性效應(yīng)和腫瘤性轉(zhuǎn)化效應(yīng)的敏感性的化學(xué)保護性試劑。化學(xué)保護劑可以來自于植物或者是合成化合物。已經(jīng)產(chǎn)生了天然出現(xiàn)的誘導(dǎo)物的合成類似物，并且顯示這些合成類似物阻斷動物中的化學(xué)致癌作用。(見Posner等(1994)J.Med.Chem.37:170-176；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3147-3150；Zhang等(1994)Cancer Res.(Suppl)54:1976s-1981s)。
已經(jīng)開發(fā)出測量植物提取物增加或誘導(dǎo)2相酶活性的潛能的高效方法(Prochaska和Santamaria(1988)Anal.Biochem.169:328-336和Prochaska等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2394-2398)。此外，這些方法已經(jīng)用于分離植物中引起誘導(dǎo)物活性的化合物，以及用于評估這些化合物和它們的合成類似物的抗致癌活性(Zhang等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2399-2403和Posner等(1994)J.Med.Chem.17:170-176)。
這些方法已經(jīng)鑒定十字花科植物為誘導(dǎo)物活性的可能來源。然而，根據(jù)變種以及生長和收獲條件，各個植株間的誘導(dǎo)物活性水平是高度易變的。
現(xiàn)在知道十字花科植物的大部分誘導(dǎo)物活性是源于異硫氰酸酯以及它們的生物發(fā)生前體芥子油苷的存在以及其量。芥子油苷通過黑芥子酶(一種葡糖硫苷葡糖水解酶)轉(zhuǎn)化為異硫氰酸酯。黑芥子酶和芥子油苷一般在細胞中是分離開的。假如細胞受到損傷，導(dǎo)致細胞區(qū)室化的破壞，則黑芥子酶與芥子油苷接觸并將它們轉(zhuǎn)化成異硫氰酸酯。
雖然芥子油苷本身并不是哺乳動物2相酶的誘導(dǎo)物，但它們通過黑芥子酶活性的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是哺乳動物2相酶的誘導(dǎo)物。因此，在QR活性的鼠肝癌細胞生物測定中，異硫氰酸酯產(chǎn)物正是2相酶的有效單功能誘導(dǎo)物。
然而，并非所有的芥子油苷都產(chǎn)生2相酶誘導(dǎo)物異硫氰酸酯。某些芥子油苷(如烷基硫代烷基芥子油苷(alkylthioalkyl glucosinolate))產(chǎn)生有效的化學(xué)保護劑，即異硫氰酸酯。其它芥子油苷(如吲哚芥子油苷)產(chǎn)生如吲哚-3-甲醇和吲哚-3-乙腈的化合物，而這些化合物由于一些原因是有問題的。第一，這樣的化合物是雙功能誘導(dǎo)物；也就是說，它們同時誘導(dǎo)2相酶和1相酶。1相酶可以激活異生素，因此產(chǎn)生致癌劑。(Prochaska和Talalay(1988)Cancer Res.48:4776-4782)。第二，所述吲哚芥子油苷僅僅是2相酶的弱誘導(dǎo)物(Fahey JW等(1998)，F(xiàn)UNCTIONAL FOODS FOR DISEASE PREVENTION I的第2章。Shibamoto T.等(編輯)，第16-22頁，ACS Symposium Series 701,AmChem Soc,Washington DC)。第三，這些化合物本身作為腫瘤促進劑起作用(Kim DJ等(1997)Carcinogenesis 18(2):377-381)。最后，這些化合物在胃中遭遇的酸性條件下會形成縮合產(chǎn)物，所述縮合產(chǎn)物是與二氧芑(TCDD)非常相似的有力致癌劑(Bjeldanes LF等(1991)ProcNat Acad Sci USA 88:9543-9547)。
因此，誘導(dǎo)物活性的量取決于十字花科植物中存在的芥子油苷的質(zhì)量以及數(shù)量。例如，市場階段(market stage)的嫩莖花椰菜和花椰菜中含有目前在蔬菜中鑒定到的最高水平的烷基硫代烷基芥子油苷、4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷和3-甲基亞磺酰丙基芥子油苷。然而，它們還含有相似水平的吲哚芥子油苷、蕓苔葡糖硫苷(吲哚基-3-甲基芥子油苷)、新葡糖蔓菁苷和4-羥基蕓苔葡糖硫苷。另一方面，嫩莖花椰菜和花椰菜萌發(fā)的種子、籽苗和幼小的小植株含有濃度比市場階段蔬菜高的芥子油苷。在籽苗中存在的芥子油苷的量在某種程度上取決于吸漲和萌發(fā)時芥子油苷從種子的滲漏。
種子吸漲和萌發(fā)、以及引發(fā)、滲透調(diào)節(jié)(osmocoditioning)、matri-conditioning等等過程雖然主要與水到種子和幼苗中的凈流入量有關(guān)，但一般也涉及化學(xué)藥品從萌發(fā)中的種子的滲漏或瀝濾。雖然一些滲漏是不可避免的，但從種子滲漏的化學(xué)物質(zhì)的量可以通過種子所放置的環(huán)境來調(diào)節(jié)。此外，滲漏的量還與種子批的質(zhì)量以及種子的類型有關(guān)。
十字花科的種子的瀝濾液可以顯示有效的抗生素活性。該活性不僅有效對抗一定范圍的人類病原體，而且有效對抗其它在商品綠色籽苗(如豆籽苗和綠色多葉籽苗)生產(chǎn)系統(tǒng)中普遍生長旺盛或共存、因此有效污染這些系統(tǒng)的微生物。萌發(fā)中的十字花科植物種子的抗生素活性，在種子和幼苗以及由它們得到的瀝濾液中，與種子的芥子油苷含量有關(guān)。綠色籽苗工業(yè)的主要原材料，即苜蓿種子的瀝濾液實際上刺激大腸桿菌(Escherichia coli)的生長，但十字花科種子(如嫩莖花椰菜、花椰菜、羽衣甘藍、日本蘿卜、甘藍、芝麻菜)的瀝濾液含有抑制大腸桿菌生長的芥子油苷以及它們的異硫氰酸酯同類物(congener)(如蘿卜苷(glucoraphanin)和1-異硫氰酸基-4R-[甲基亞硫?；鵠丁烷)。因此，蘿卜苷和它的異硫氰酸酯同類物1-異硫氰酸基-4R-[甲基亞硫?；鵠丁烷不僅在哺乳動物中誘導(dǎo)使異生素解毒的2相酶、具有化學(xué)保護性，而且它們還是抗微生物劑。
然而，吸漲期間的滲漏降低了種子和籽苗的芥子油苷含量，因此降低了它們的抗生素活性以及抗致癌活性。此外，目前的商品綠色籽苗生產(chǎn)系統(tǒng)也導(dǎo)致瀝濾物有僅僅非常低的抗生素活性。
因此，本領(lǐng)域內(nèi)有需要鑒定特定的十字花科植物，所述植物產(chǎn)生用于化學(xué)保護的高水平的2相酶誘導(dǎo)物活性。還有需要鑒定產(chǎn)生已知譜系的2相酶活性特異性誘導(dǎo)物的植物，以增加失活所靶向的特定致癌劑或多類致癌劑的有效性。此外，有需要產(chǎn)生包含提高水平的2相酶誘導(dǎo)物活性的種質(zhì)，并且有需要開發(fā)有效和高效地操作在特定變種和系中所產(chǎn)生的誘導(dǎo)物譜系的方法。最后，有需要獲得在萌發(fā)和抽芽時顯示芥子油苷滲漏降低的種子和籽苗。還有需要為商品綠色籽苗生產(chǎn)開發(fā)方法，所述方法導(dǎo)致瀝濾液中抗生素產(chǎn)生增加，而并不顯著降低在市售籽苗組織中存在的化學(xué)防護活性。
因此，最理想的是獲得擁有一致的化學(xué)防護活性質(zhì)量和數(shù)量的十字花科植物變種。還最好獲得這樣的十字花科植物變種所述十字花科植物變種在抽芽過程中產(chǎn)生高水平的抗生素活性，因此降低了所述籽苗會被人類病原體污染的風(fēng)險。還最好獲得也擁有高質(zhì)量化學(xué)防護活性的十字花科植物變種。這樣的十字花科植物變種包括開放傳粉和近交的嫩莖花椰菜系和花椰菜系，這些系含有相對于吲哚芥子油苷水平來說高水平的烷基硫代烷基芥子油苷。
還最好獲得顯示在萌發(fā)和抽芽時芥子油苷滲漏降低的十字花科植物種子和籽苗。也最好獲得商品綠色籽苗生產(chǎn)方法，該方法導(dǎo)致瀝濾液中抗生素產(chǎn)生增加，而并不顯著降低在市售籽苗組織中存在的化學(xué)防護活性。
發(fā)明簡述使用本發(fā)明的技術(shù)，通過產(chǎn)生新型種質(zhì)，可以增強十字花科的蔬菜、種子和籽苗的抗腫瘤質(zhì)量。
因此，本發(fā)明的一個目標是提供產(chǎn)生新型十字花科種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法，所述種質(zhì)含有顯著量的癌癥化學(xué)保護化合物。
本發(fā)明的另一個目標是提供產(chǎn)生新型十字花科植物種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法，所述種質(zhì)含有大量2相酶誘導(dǎo)物，并且基本不含有1相酶誘導(dǎo)物。
本發(fā)明的再一個目標是提供產(chǎn)生十字花科植物種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法，所述種質(zhì)含有大量2相酶誘導(dǎo)潛力以及無毒水平的吲哚芥子油苷和它們的降解產(chǎn)物。這樣的種質(zhì)在最終用于市場銷售和隨后的使用的合適組織中含有提高的吲哚芥子油苷/烷基芥子油苷比例。這樣的組織包括種子、籽苗和市場階段的頭狀花序(heads)。
本發(fā)明的另一個目的是提供這樣的方法通過選擇提高的烷基硫代烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例，創(chuàng)造新型近交或雙單倍體十字花科植物種質(zhì)，尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì)。
本發(fā)明的再一個目的是提供含有提高的烷基硫代烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的新型近交或雙單倍體十字花科植物種質(zhì)，尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是提供產(chǎn)生新型十字花科植物種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法，所述十字花科植物種質(zhì)具有瀝濾能力降低、芥子油苷含量提高的種子。
本發(fā)明的再一個目的是提供這樣的方法在一定條件下使十字花科種子和籽苗萌發(fā)，所述條件增加對抗一定范圍人類病原體的抗生素活性，并且增加所述籽苗的化學(xué)防護活性。
通過提供產(chǎn)生具有增強的化學(xué)防護特性的新型十字花科植物種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法，達到這些目的和其它目的，所述方法包括(1)提供雙單倍體植株的群體，并(2)選擇具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的單株。或者或此外，所述單株也產(chǎn)生萌發(fā)和抽芽時種子物質(zhì)滲漏降低、導(dǎo)致芥子油苷含量提高的種子。可以通過花藥培養(yǎng)技術(shù)從親本植株獲得雙單倍體植株的群體。
所述選擇步驟可以包括篩選每株植株以確定它的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例。此外，所述篩選步驟可以包括這樣的步驟從植株制備提取物、并測定所述提取物中烷基芥子油苷和吲哚芥子油苷的量。最后，所述篩選步驟可以包括篩選由每株植株產(chǎn)生的種子，以測定從種子滲漏的物質(zhì)的量，并測定在所述種子本身和這樣的滲漏物中存在的芥子油苷含量。
還提供產(chǎn)生具有增強的化學(xué)防護特性的新型自交十字花科植物種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法，所述方法包括(1)提供雙單倍體植株的群體，并(2)選擇具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的單株，然后(3)使選定的植株自交，并選擇來自自交植株的具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的后代。或者，或者此外，所述單株也產(chǎn)生瀝濾能力降低、導(dǎo)致芥子油苷含量提高的種子。來自所述自交植株的后代也產(chǎn)生種子物質(zhì)的滲漏降低的種子。
還提供了創(chuàng)造具有增強的化學(xué)防護特性的新型近交十字花科植物種質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟(1)提供誘變處理植株的群體，然后(2)選擇具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的單株?；蛘?，或者此外，所述單株也產(chǎn)生瀝濾能力降低、導(dǎo)致芥子油苷含量提高的種子。
還提供了這樣的十字花科植物變種所述十字花科植物變種含有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例，其中所述提高的比例比在產(chǎn)生出所述變種的親本植株中觀察到的所述比例大約10％，更優(yōu)選20％，最優(yōu)選30％或更多?；蛘撸蛘叽送?，所述十字花科植物變種產(chǎn)生萌發(fā)和抽芽時種子物質(zhì)的滲漏降低的種子。
還提供了這樣的方法通過以一定的水對干種子的比例使種子吸漲并萌發(fā)，在一定條件下萌發(fā)十字花科種子和籽苗的方法，所述條件增加在抽芽環(huán)境中的抗生素活性并增加所述籽苗的化學(xué)防護活性，所述水對干種子的比例剛好足以允許所述籽苗在正常的商業(yè)化抽芽期中的正常生長，而并不導(dǎo)致從所述籽苗的任何明顯的流出。
因此，本發(fā)明涉及選擇植株的方法，所述方法包括測定植物組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，如果該比例是特定數(shù)值，則選擇該植株。所述植株最好是雙單倍體植株，例如通過花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得的雙單倍體植株，或者所述植株是經(jīng)誘變處理的植株，如用化學(xué)誘變劑(如甲基磺酸乙酯)誘變的植株，其中所述植株在所述測定步驟前經(jīng)過誘變處理。
所述植株有利地是十字花科植物如嫩莖花椰菜，最好屬于由以下選出的栽培品種Saga、DeCicco、珠穆朗瑪峰(Everest)、翡翠城(Emerald City)、Packman、Corvet、Dandy Early、皇帝(Emperor)、Mariner、綠彗星(Green Comet)、Green Valiant、Arcadia、CalabreseCaravel、Chancellor、Citation、巡洋艦(Cmiser)、早紫萌芽紅箭(EarlyPurple Sprouting,Red Arrow)、Eureka、Excelsior、大帆船(Galleon)、Ginga、Goliath、綠公爵(Green Duke)、綠色地帶(Greenbelt)、意大利萌芽(Italian Sprouting)、HiSierra、晚紫萌芽(Late Purple Sprouting)、晚冬萌芽白星(Late Winter Sprouting White Star)、Legend、Leprechaun、馬拉松(Marathon)、水手(Mariner)、Minaret(Romanesco)、杰出典范(Paragon)、愛國者(Patriot)、Premium Crop、Rapine(Spring Raab)、Rosalind、Salade(Fan Raab)、武士(Samurai)、Shogun、短跑選手(Sprinter)、蘇丹(Sultan)、Taiko、和Trixie、以及海盜(Viking)。
或者，所述植株是十字花科植物如花椰菜，最好屬于由以下選出的栽培品種Alverda、Amazing、Andes、勃艮第王后(BurgundyQueen)、Candid Charm、Cashmere、圣誕白(Christmas White)、Dominant、Elby、雪球(Snowball)以及雪球的選擇物、Fremont、Incline、Milkyway Minuteman、Rushmore、S-207、Serrano、Sierra Nevada、Siria、雪冠(Snow Crown)、雪片(Snow Flake)、Snow Grace、Snowbred、Solide、Taipan、紫羅蘭王后(Violet Queen)、白男爵(White Baron)、白主教(WhiteBishop)、White Contessa、白暈(White Corona)、白鴿(White Dove)、白色閃光(White Flash)、白狐(White Fox)、白騎士(White Knight)、白光(White Light)、白王后(White Queen)、白巖(White Rock)、白帆船(White Sails)、白夏(White Summer)、白頂(White Top)、和Yukon。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生后代植株的方法，所述方法包括測定有潛力的親本植株的一種組織中的烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷含量的比例，如果該比例是特定的數(shù)值，則選擇所述有潛力的親本植株，并從所述選出的植株產(chǎn)生后代植株。有利地是，所述后代植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例高于所述選定植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，并且所述后代植株的所述組織以及所述選定植株的所述組織屬于同一類型。本發(fā)明也涉及通過這種方法產(chǎn)生的后代植株。
在優(yōu)選的實施方案中，所述后代植株的所述組織中的該比例比所述選定植株的所述組織中的該比例至少高10％、20％、30％、50％或100％。在另一優(yōu)選實施方案中，所述后代植株的所述組織中的該比例是所述選定植株的所述組織中的該比例的至少10倍或100倍。而在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述后代植株的所述組織中的該比例比所述選定植株的所述組織中的該比例高10％到高100％、高20％到高80％、或高30％到高60％。在再一優(yōu)選實施方案中，所述后代植株的所述組織中的該比例是所述選定植株的所述組織中的該比例的10倍到100倍之間、或25倍到75倍之間。所述后代植株有利地是通過使所述選定植株自交產(chǎn)生，或者所述后代植株是雜種植株。
本發(fā)明還涉及十字花科植株，如嫩莖花椰菜植株或花椰菜植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于6、10、25、50、100或1000。在優(yōu)選的實施方案中，所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例在6到1000之間、10到500之間、25到250之間或50到100之間。
本發(fā)明還涉及選擇種子或籽苗的方法，所述方法包括(a)向種子或籽苗加一定量的水，(b)測定所述種子或籽苗的瀝濾物中芥子油苷的含量，并(c)假如該濃度是特定值，則選定所述種子或籽苗。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生后代植株的方法，所述方法包括(a)向種子或籽苗加一定量的水，(b)測定所述種子或籽苗的瀝濾物中芥子油苷的含量，并(c)假如該濃度是特定值，則選定所述種子或籽苗，然后(d)由所述選定的種子或籽苗產(chǎn)生后代植株。
本發(fā)明還涉及抑制或防止微生物在能夠維持微生物生長的環(huán)境中生長的方法，所述方法包括以抑制微生物生長的量給予所述環(huán)境十字花科種子瀝濾液或十字花科籽苗瀝濾液。所述微生物有利地是細菌，如埃希氏菌屬(Escherichia)(如大腸桿菌)或葡萄球菌屬(Staphylococcus)(如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。所述瀝濾液最好是嫩莖花椰菜瀝濾液或花椰菜瀝濾液。理想的是，所述瀝濾液含有芥子油苷或異硫氰酸酯。
本發(fā)明還涉及制備籽苗的方法，所述方法包括(a)提供一定量的種子，(b)向所述種子加每g種子0.6到1.0g的水，(c)使接受澆水的種子萌發(fā)并形成籽苗，然后(d)每24小時向所述籽苗加每株籽苗5到9mg的水直至24到120小時，由此制備籽苗。步驟(b)最好包括向所述種子加每g種子0.7到0.9g(最好0.8g)的水。步驟(d)最好包括每24小時向所述籽苗加每株籽苗.6到.8mg(理想的是.7mg)的水直至24到120小時。步驟(d)最好包括每24小時向所述籽苗加每株籽苗.5到.9mg的水直至48到120小時(理想的是72小時)。所述籽苗有利地是十字花科籽苗，如嫩莖花椰菜籽苗或花椰菜籽苗。
本發(fā)明的其他目標、特性和好處將通過下面的詳細描述而變得明顯。然而，應(yīng)當理解所述詳細描述和特定具體實施例當指明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時，是僅作為例證給出，因為通過該詳細描述，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將變得顯而易見。
附圖簡述

圖1顯示了嫩莖花椰菜籽苗瀝濾液和苜蓿籽苗瀝濾液對于大腸桿菌在0.1X Luria肉湯上生長的效應(yīng)。
圖2顯示了在萌發(fā)期間不同時間收集到的嫩莖花椰菜籽苗瀝濾液對于大腸桿菌生長的效應(yīng)。
圖3顯示了在從嫩莖花椰菜籽苗收集到的瀝濾液中芥子油苷和異硫氰酸酯濃度對大腸桿菌在0.1X Luria肉湯上生長的效應(yīng)。
圖4顯示了在萌發(fā)期間不同時間收集到的苜蓿籽苗瀝濾液對于大腸桿菌生長的效應(yīng)。
優(yōu)選實施方案的詳細描述1．定義在下面的描述中，將廣泛地使用許多術(shù)語。提供下面的定義以利于理解本發(fā)明。
花藥培養(yǎng)是體外培養(yǎng)花藥以獲得單倍體植株或純合再生植株。當包含小孢子或未成熟花粉粒的花藥在合適條件下在營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長時，所述花藥產(chǎn)生胚，所述胚又能再生成植株。由于所培養(yǎng)的小孢子細胞和未成熟花粉粒來自于進行了減數(shù)分裂的細胞，所以它們的染色體數(shù)目是親本植株染色體數(shù)目的一半，因此由這些培養(yǎng)細胞再生的植株是單倍體。
化學(xué)保護劑或化學(xué)防護劑是降低哺乳動物對于致癌劑的毒性效應(yīng)和腫瘤性轉(zhuǎn)化效應(yīng)的敏感性的合成的或天然出現(xiàn)的化學(xué)試劑。
雙單倍體是通過使單倍體植株的染色體含量加倍而產(chǎn)生的雙倍體植株。單倍體植株一般從花藥培養(yǎng)獲得；或者人工使染色體加倍，如通過秋水仙素處理使染色體加倍，或者使染色體自發(fā)加倍。雙單倍體在所有基因座(genetic loci)上都是純合的。
提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例是這樣的比例該比例大于在約70％、優(yōu)選80％、最優(yōu)選90％的測試植株群體中觀察到的所述比例，或者比衍生出所述測試植株的親本中觀察到的所述比例大、最好大20％?；蛘咛岣叩谋壤遣⒉惶烊怀霈F(xiàn)的比例，因為該比例是人工誘導(dǎo)的，如在組織培養(yǎng)期間通過誘變處理或體細胞克隆變異誘導(dǎo)的，并且該比例顯著大于衍生出所述測試植株的植株群體中一般出現(xiàn)的所述比例。
芥子油苷的分布型是確定在植株中測到的芥子油苷的類型以及每種芥子油苷類型的量。通過測定烷基芥子油苷和吲哚芥子油苷的量并確定烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，可以確定芥子油苷分布型。
誘導(dǎo)物活性或2相酶誘導(dǎo)活性是化合物誘導(dǎo)2相酶活性的能力的量度。(見Prochaska和Santamaria(1988)Anal.Biochem.169:328-336和Prochaska等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2394-2398)。
近交系或繁育系(breeding line)是純合或接近純合的植物系。一般地說，通過常規(guī)的植物培育技術(shù)產(chǎn)生這樣的系；然而，最近可以通過組織培養(yǎng)技術(shù)、如產(chǎn)生雙單倍體而獲得這樣的系。近交系用于產(chǎn)生雜種。
誘導(dǎo)物潛力或2相酶誘導(dǎo)潛力是植物組織中誘導(dǎo)物活性的混合量的量度，所述誘導(dǎo)物活性由異硫氰酸酯加上能夠被黑芥子酶轉(zhuǎn)化成異硫氰酸酯的芥子油苷提供。芥子油苷本身并不是哺乳動物2相酶的直接誘導(dǎo)物；而它們的代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯是誘導(dǎo)物。
栽培品種或變種是一群相似的植株，它們屬于同一物種，并且通過結(jié)構(gòu)特征和生產(chǎn)性能可以與同一物種內(nèi)的其它變種區(qū)分開來。變種的兩個基本特征是同一性和能生殖性。同一性是必需的，以便可以識別變種并與該作物物種內(nèi)的其它變種區(qū)分開來。區(qū)分特征可以是形態(tài)學(xué)特征、顏色標記、生理功能、病害反應(yīng)或生產(chǎn)性能。大多數(shù)農(nóng)業(yè)變種在鑒別該變種的那些特征上是純合的。能生殖性是必需的，由此鑒別該變種的特征會在后代中再現(xiàn)。一個變種來自于一個品系；由單基因型或基因型的混合物增殖得到的群體被稱為品系、試驗系或系。一旦鑒定該品系是優(yōu)良的，人們就為其命名、使其增殖并使其作為“栽培變種”或“栽培品種”在商業(yè)上可得。詞語“變種”和“栽培品種”可互換使用，雖然栽培品種一般用于科學(xué)文獻中，而變種是美國農(nóng)場主和種子貿(mào)易使用的術(shù)語。2．描述十字花科植物在降低人類的癌癥發(fā)生率中提供的主要保護機制依賴于植物組織中微量化學(xué)成分的存在，當所述微量化學(xué)成分傳遞給哺乳動物細胞時，提高使致癌劑解毒的2相酶的水平。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過產(chǎn)生具有提高的化學(xué)防護活性的新型近交系而增加十字花科植物的抗致癌活性。所述增強的化學(xué)保護活性是源于提高的烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例。例如，可以通過定量提高特定烷基芥子油苷(如烷基硫代烷基芥子油苷)的水平、或定量降低吲哚芥子油苷的水平而獲得這樣的提高的比例。也可以通過產(chǎn)生新型近交十字花科植物系而增強市售籽苗組織的化學(xué)防護活性，其中所述新型自交十字花科植物系產(chǎn)生種子物質(zhì)滲漏降低的種子。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)假如使供應(yīng)給發(fā)育中的十字花科植物籽苗的水量最小化，或使其降低到保持發(fā)育中的籽苗濕潤但并不濕透的水平，則在瀝濾物中這樣的抗生素的濃度提高，以致對抗?jié)撛谖廴镜奈⑸锏囊种菩?yīng)得到增強，所述潛在污染的微生物包括人類病原體和食物中毒生物(food poisoning organism)，例如大腸桿菌、沙門氏菌屬(Salmonella)物種以及李斯特菌屬(Listeria)物種。另一方面，用減少的水培養(yǎng)這樣的籽苗導(dǎo)致芥子油苷以及其它無機離子和有機化合物的瀝濾減少，這導(dǎo)致在最終消費的植物組織中這些化合物的水平提高。因此，例如，在用更少量的水萌發(fā)的籽苗組織中可以提高表現(xiàn)出癌預(yù)防特性的蘿卜苷的水平。
產(chǎn)生這樣的新型種質(zhì)的方法包括將用于鑒定和選擇具有提高的烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例的植物組織的新型篩選技術(shù)與常規(guī)和非常規(guī)培育技術(shù)結(jié)合起來。這樣的方法尤其導(dǎo)致具有提高的烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例的十字花科植物變種，更具體地說是嫩莖花椰菜變種和花椰菜變種?；蛘?，或者此外，篩選包括評估在萌發(fā)和抽芽時種子物質(zhì)滲漏減少的種子，尤其是芥子油苷從種子的滲漏減少的種子。
在所述要求保護的方法中用于產(chǎn)生具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的植株的十字花科植物來自于十字花科、Brassiceae族和Brassicinae亞族。所述十字花科植物最好來自于甘藍(Brassicaoleracea)種群并且其中包括acephala(羽衣甘藍、甘藍、culy cale)、medullosa(marowstem kale)、ramosa(thousand head kale)、alboglabra(芥藍)、botrytis(、花椰菜、嫩莖花椰菜)、costata(葡萄牙卷葉菜)、gemmifera(抱子甘藍)、gongylodes(球莖甘藍)、italica(嫩莖花椰菜)、palmifolia(Jersey kale)、sabauda(皺葉甘藍)、sabellica(羽衣甘藍)、selensia(羽衣甘藍)以及capitata(甘藍)。在所述要求保護的方法中用于產(chǎn)生具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的植株的其它十字花科植物其中包括Lepidium sativum(獨行菜)、白芥(Sinapis alba)和S.niger(芥菜)、蘿卜(Raphanus sativum)(radish daikon)、Eruca satica(芝麻菜)以及它們的變種間、種間或?qū)匍g雜種。篩選芥子油苷分布型為篩選大量單株以選擇那些具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的植株，有必要開發(fā)用于分離、鑒定和定量在植物提取物中存在的不同類型芥子油苷的改進的技術(shù)。
使各種芥子油苷分離開來是困難的，因為這些分子帶有高電荷并且是水溶性的；不同分子的分離取決于極性較小的側(cè)鏈的特性。已經(jīng)開發(fā)出許多不盡理想的色譜方法以用于芥子油苷的離析和分離。(見，例如，Betz,JM和Fox,WD(1994)FOOD PHYTOCHEMICALSFOR CANCER PREVENTION.I.FRUITS AND VEGETABLES,Huang,MT等(編輯)ACS Symposium Series,546,第181-196頁,Am Chem Soc,Washington,DC；Heaney,RK和Fenwick,GR(1987)GLUCOSINOLATES IN RAPESEEDS:ANALYTICAL ASPECTS,Wathelet,JP(編輯),第177-191頁,Nijhoff Dordrecht,荷蘭；Wathelet,JP(1987)GLUCOSINOLATES IN RAPESEEDS:ANALYTICALASPECTS,Nijhoff Dordrecht，荷蘭)。這些色譜方法包括離子交換、氣液色譜法(GLC)以及高壓液相色譜法(HPLC)，它們中的大部分涉及通過酶促脫硫酸鹽(sulfate removal)和/或硅烷化的化學(xué)改性。
最近發(fā)展出一種分析植物提取物中芥子油苷含量的簡單和直接的策略；該策略涉及廣泛可得的技術(shù)的新組合。(Prestera，T等(1996)Anal.Biochem.239:168-179；通過引用完整地結(jié)合到本文中。)該分析策略也提供了不必借助衍生作用而鑒定和定量植物提取物中的芥子油苷的有力技術(shù)。
將植物組織于維持在約-50℃的干冰/乙醇浴中用10倍體積的二甲基亞砜、二甲基甲酰胺和乙腈(三溶劑)的等體積混合物勻漿，制備植物提取物。根據(jù)樣品大小，在玻璃勻漿器、Brinkmann Polytron勻漿器或Waring Blender中勻漿樣品。其它提取溶劑包括沸騰的乙醇、沸水、冰冷的水以及乙腈。例如，也可以將收獲的植物組織浸入沸水中，然后是短時間的勻漿，由此制備植物提取物。在所有情況下，離心勻漿物，可選地過濾上清以去處剩余的顆粒?？梢詫⒌玫降拇炙蕴崛∥锉４嬖?20℃到-80℃直至進行分析。
然后通過序貫分析來分離、鑒定和定量來自粗植物提取物的完整芥子油苷。該程序包括在過量這些抗衡離子的存在下進行芥子油苷的疏水性四烷基銨鹽的反相離子對色譜(PIC)，將這些芥子油苷鹽轉(zhuǎn)化成它們的銨鹽，然后進行直接陰離子快速原子轟擊(FAB)光譜分析和氨化學(xué)電離(CI)質(zhì)譜法分析，最后進行高分辨率核磁共振(3HNMR)波譜法。Prestera,T等(1996)Anal.Biochem.239:168-179提供了細節(jié)，該文獻通過引用完整地結(jié)合到本文中。
最好在一臺配備有光電二級管陣列檢測器的Waters HPLC系統(tǒng)上，使用含5mM十四烷基溴化銨的乙腈/水(1∶1，體積比)以3ml/分鐘的流速在反相柱(Whatman Partisil 10 ODS-2；250×4mm)上色譜分析植物提取物(見Prestera,T.等(1996)Anal.Biochem.239:168-179)。使用黑芥子苷(烯丙基芥子油苷(allyl glucosinolate))作為標準。烷基硫代芥子油苷，如蘿卜苷、蕓苔葡糖硫苷和新葡糖蔓菁苷在235nm處的相對積分吸收面積(relative integrated absorbance area)分別是等摩爾量的黑芥子苷在235 nm處的相對積分吸收面積的1.00倍、1.22倍和2.70倍(Fahey JW等(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA 94:10367-10372；Shapiro TA等(1998)Cancer Epidemiol.Biomark.Prevent.7:1091-1100)。
根據(jù)培育程序的目標從組織取樣；因此，取樣的組織可以包括市場階段的頭狀花序(在它們開放前是花芽)、葉組織、種子組織和/或籽苗組織。當要培育市場階段頭狀花序內(nèi)所需的芥子油苷分布型時，最好在花芽開放前從花芽組織取樣。篩選種子瀝濾液可以根據(jù)萌發(fā)和抽芽期間種子物質(zhì)滲漏的量、尤其是釋放到所述瀝濾液中的芥子油苷的量和類型來篩選各個植株的種子。
根據(jù)發(fā)芽工業(yè)中一般使用的方法，首先消毒種子，通常用在水中有約20％漂白劑的漂白劑溶液進行消毒，然后用水徹底清洗種子。隨后將種子置于萌發(fā)容器內(nèi)；這樣的室可以包括扁平的托盤，所述托盤可以是傾斜的，或者這樣的室可以是適于運輸和銷售的容器。后一種容器類型一般是在底部包括水墊的塑料盒或塑料罐。這些容器容許光線通過，同時提供機械保護的屏障。這樣的托盤或容器最好設(shè)計或改造或制造成允許清洗萌發(fā)中的種子并收集得到的清洗溶液或瀝濾液，同時促進正常商業(yè)化生長期間籽苗的正常生長。已知許多培育籽苗的方法，如美國專利第3,733,745號、美國專利第3,643,376號、美國專利第3,945,148號、美國專利第4,130,964號、美國專利第4,292,760號或美國專利第4,086,725號所例證。
然后用定量的水以確定間隔清洗所述種子確定時間；隨后收集這些清洗水或瀝濾液，并測定所述瀝濾液中種子物質(zhì)的含量?？梢允褂酶鞣N眾所周知的測定滲漏的或釋放的種子物質(zhì)的方法，包括總干重和測定釋放的蛋白質(zhì)和糖。此外，此外或用另一種方法，可以如上所述測定釋放的芥子油苷的量和分布型。選擇育種程序的目的將決定哪些植株進入篩選程序以及選擇哪些植株進行進一步的培育。其它要考慮的因素是從哪些組織、在哪個階段取樣；因此，一些程序目標在于市售蔬菜產(chǎn)品，如嫩莖花椰菜和花椰菜的頭狀花序或小花，而其它程序的目的在于小生境(niche)市場產(chǎn)品如籽苗或更成熟的植株部分，由這些部分可以制備所需質(zhì)量的茶、滲出物、煎劑或提取物。
根據(jù)種質(zhì)的類型和隨后的培育策略，可以篩選不同類型的植株群體。最好篩選純合植株的群體；這樣的純合植株最有可能通過組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生出來，但也可以通過常規(guī)培育技術(shù)產(chǎn)生出它們。其它適于篩選的優(yōu)選植物群體包括那些已經(jīng)接受誘變處理的植株。
可用于產(chǎn)生純合植株的組織培養(yǎng)技術(shù)包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)包含小孢子或未成熟花粉粒的花藥用于產(chǎn)生單倍體小植株。然后通過適當程序使回收的單倍體小植株的染色體數(shù)目加倍，產(chǎn)生完全純合的二倍體植株，即雙單倍體植株。
增殖通過篩選程序選定為所需要的雙單倍體植株，并進一步評估其農(nóng)學(xué)特性?；蛘?，立即利用所述植株增殖物作為雜交培育中的近交系以使植株異花受精。與常規(guī)培育程序所需的時間相比，通過該程序產(chǎn)生栽培品種或近交系所需的時間減少了幾個世代。
用于嫩莖花椰菜組織的花藥培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的(Keller,WA等(1975)Can.J.Genet.Cytol.17:655-666；Keller,WA和Armstrong,KC(1988)Euphytica 32:151-159；Arnison,PG等(1990)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 20:147-155；Arnison,PG等(1990)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 20:217-222；Chiang,MS(1985)Can.J.Plant Sci.65:1033-1037)。一般來說，該技術(shù)涉及在花出現(xiàn)前從主花序選擇芽、表面消毒所述芽、然后接種所述組織到培養(yǎng)基上。從小孢子產(chǎn)生胚，隨后將所述胚再生成植株。在已報道的培養(yǎng)條件下，約一半植株是雙單倍體，而其余是單倍體、四倍體及以其它倍性?？梢酝ㄟ^DNA流式細胞術(shù)鑒定雙單倍體(Arumaganathan,K.和Earle,ED(1991)Agronomie 11:727-736)。可以通過合適處理使單倍體植株內(nèi)的染色體數(shù)目加倍，或者染色體數(shù)目可以自發(fā)加倍，所述處理如使用秋水仙素用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法處理。
可以通過減少或剔除吲哚芥子油苷的合成或通過提高烷基芥子油苷的合成來改變芥子油苷的分布型。有幾種達到該目的的技術(shù)。例如，一種方法是僅僅利用組織培養(yǎng)期間發(fā)生的體細胞克隆變異。另一種方法是對植物進行誘變處理，以增加具有所需芥子油苷分布型的植株出現(xiàn)的頻率。而另一種方法是失活或剔除涉及吲哚芥子油苷合成的基因，例如通過將DNA插入這些基因中。
誘變處理包括電離輻射和化學(xué)誘變劑，而后者是目前優(yōu)選的。最廣泛使用的化學(xué)藥品是甲基磺酸乙酯(EMS)。雖然最一般的是處理種子，但也可以處理花藥、生活植株或植株的部分，所述部分包括芽、根和休眠插條。處理一般包括將所述植物或所述植物的部分浸泡在化學(xué)誘變劑的溶液中。然后用經(jīng)過處理的所述植物材料產(chǎn)生完整的植株，隨后對所述植株進行篩選和選擇程序。植物誘變方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。例如，見Malmberg,R.L.，“植物突變體的產(chǎn)生和分析，以擬南芥(Arabidopsis thaliana)為重點”，METHODS INPLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY,B.R.Glick和J.E.Thompson，編輯(CRC Press,Boca Raton 1993)。
通過使用來自宿主植物或來自異種來源的可動DNA序列(如T-DNA或轉(zhuǎn)座子)進行DNA插入、而失活或剔除涉及吲哚芥子油苷合成的基因是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的技術(shù)(Koncz等，1992)。可以使用已知方法,通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)進行T-DNA插入(Hoekema等，1983；美國專利第5,149,645號)，可以通過眾所周知的方法完成轉(zhuǎn)座子插入(Fedoroff等，1984；美國專利第4,732,856號和美國專利第5,013,658號)。所使用的轉(zhuǎn)座因子可以是自主轉(zhuǎn)座子、非自主轉(zhuǎn)座子或自主/非自主轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，如玉米Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。
選出用于篩選的植株最好是那些具有所需農(nóng)學(xué)特性的植株。然而，如果選出用于篩選的植株不太合乎要求，那么就可以通過常規(guī)培育技術(shù)將所需芥子油苷分布型的性狀引入商業(yè)上所需的變種。
同時優(yōu)選在相似條件下培養(yǎng)所述選出用于篩選的植株，并在發(fā)育的相似階段收獲所述植株。這便利了不同單株間的比較，因為已知芥子油苷的數(shù)量和質(zhì)量由于不同的植物組織以及由于不同的發(fā)育階段而不同，并且由于不同的培養(yǎng)條件而不同。選出用于篩選的植物部分包括種子、籽苗和小花。選擇的組織取決于所產(chǎn)生的種質(zhì)的最終市場。根據(jù)用于篩選的組織的選擇，可以選擇不同的單株，因為在一株植株內(nèi)，每種組織內(nèi)的芥子油苷分布型可能不同，并且看起來在不同組織的分布型間沒有相關(guān)性。例如，一株植株有擁有所需芥子油苷分布型的市場階段頭狀花序組織，該植株可能有這樣的籽苗所述籽苗擁有并非所需、或低于所需的芥子油苷分布型，或者具有與其它栽培品種相比非常低的總烷基硫代烷基芥子油苷水平。
選擇那些在用于終端市場的合適組織中顯示出所需芥子油苷分布型的植株以進行隨后的開發(fā)。優(yōu)選的分布型是提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例。提高的比例是這樣的比例該比例大于在約70％、優(yōu)選80％、最優(yōu)選90％的測試植株群體中觀察到的所述比例?；蛘咛岣叩谋壤沁@樣的比例該比例比親本植株中觀察到的所述比例大，優(yōu)選大10％、更優(yōu)選大至少20％、最優(yōu)選大至少30％。或者提高的比例是并不天然出現(xiàn)的比例，因為該比例是人工誘導(dǎo)的，如通過誘變處理或在組織培養(yǎng)期間的體細胞克隆變異而誘導(dǎo)，并且該比例顯著大于衍生出所述處理植株的植株群體中一般出現(xiàn)的所述比例。
或者或此外，選擇產(chǎn)生這樣的種子的那些植株進行進一步的開發(fā)所述種子在萌發(fā)和抽芽期間種子物質(zhì)的滲漏降低，尤其是芥子油苷滲漏降低。滲漏降低定義為當與親本植株中觀察到的滲漏相比、或與從中獲得所述單株的植株群體中觀察到的滲漏相比時顯著的降低。顯著的降低是與親本植株中觀察到的滲漏相比，至少10％、優(yōu)選30％、最優(yōu)選50％或更多的降低?；蛘?，顯著的滲漏降低是在僅10％、優(yōu)選5％、最優(yōu)選1％的所述植株群體中觀察到的滲漏?；蛘唢@著的降低是并不天然出現(xiàn)的降低，因為該降低是人工誘導(dǎo)的，如通過誘變處理或在組織培養(yǎng)期間的體細胞克隆變異而誘導(dǎo)，并且該降低是比衍生出所述處理植株的植株群體中一般出現(xiàn)的滲漏更小量的滲漏。植株培育一旦選擇了擁有所需芥子油苷分布型的單株，就用它們進行進一步的開發(fā)。提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例可以出現(xiàn)在市場階段的頭狀花序、籽苗、種子或其它植物部分。可以應(yīng)用下面培育程序于根據(jù)芥子油苷分布型而篩選的雙單倍體植株、誘變植株或其它來源的植株。
一般來說，根據(jù)提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷的比例的性狀(如上所述)篩選所述選定植株的后代來進行培育，其中所述比例在所需植物發(fā)育階段的所需植物部分產(chǎn)生。通過增強該性狀或?qū)⒃撔誀钆c其它重要的農(nóng)學(xué)特征組合，進一步產(chǎn)生帶有該性狀的植株。因此，可以直接用帶有選定性狀的植株建立新變種，或可以用它們作為來源以將所述性狀轉(zhuǎn)移進其它農(nóng)學(xué)上所需的變種。
在所要求保護的方法中特別有用的嫩莖花椰菜變種是Saga、DeCicco、珠穆朗瑪峰(Everest)、翡翠城(Emerald City)、Packman、Corvet、Dandy Early、皇帝(Emperor)、Mariner、綠彗星(Green Comet)、Green Valiant、Arcadia、Calabrese Caravel、Chancellor、Citation、巡洋艦(Cruiser)、早紫萌芽(Early Purple Sprouting)、紅箭(Red Arrow)、Eureka、Excelsior、大帆船(Galleon)、Ginga、Goliath、綠公爵(GreenDuke)、綠色地帶(Greenbelt)、意大利萌芽(Italian Sprouting)、晚紫萌芽(Late Purple Sprouting)、晚冬萌芽白星(Late Winter Sprouting WhiteStar)、Legend、Leprechaun、馬拉松(Marathon)、水手(Mariner)、Minaret(Romanesco)、杰出典范(Paragon)、愛國者(Patriot)、Premium Crop、Rapine(Spring Raab)、Rosalind、Salade(Fall Raab)、武士(Samurai)、Shogun、短跑選手(Sprinter)、蘇丹(Sultan)、Taiko、晚紫萌芽(Late PurpleSprouting)、明星(Light Star)和Trixie。然而，許多其它嫩莖花椰菜變種是合適的。
特別有用的花椰菜變種是Alverda、Amazing、Andes、勃艮第王后(Burgundy Queen)、Candid Charm、Cashmere、圣誕白(ChristmasWhite)、Dominant、Elby、雪球(Snowball)以及雪球的選擇物、Fremont、Incline、Milkyway Minuteman、Rushmore、S-207、Serrano、SierraNevada、Siria、雪冠(Snow Crown)、雪片(Snow Flake)、Snow Grace、Snowbred、Solide、Taipan、紫羅蘭王后(Violet Queen)、白男爵(WhiteBaron)、白主教(White Bishop)、White Contessa、白暈(White Corona)、白鴿(White Dove)、白色閃光(White Flash)、白狐(White Fox)、白騎士(White Knight)、白光(White Light)、白王后(White Queen)、白巖(WhiteRock)、白帆船(White Sails)、白夏(White Summer)、白頂(White Top)、和Yukon。然而，許多其它花椰菜變種是合適的。
所述培育程序的目的是確保所選擇的芥子油苷分布型性狀是穩(wěn)定的，確保所選擇的芥子油苷分布型性狀存在于具有所需農(nóng)學(xué)性狀的植株中或可以轉(zhuǎn)移到這樣的植株中，并確保所選擇的植株可以用于產(chǎn)生可以產(chǎn)生適合市場銷售的雜種種子的變種或系。
為確保所述增強的芥子油苷性狀是穩(wěn)定的，從所述選定的植株獲得F1代。雖然幾種方法是可行的，但優(yōu)選使所述選定的植株自體受粉以建立可以根據(jù)芥子油苷分布型進行篩選的F1子代。因為嫩莖花椰菜和花椰菜是自交不親和性植物，所以可以通過幾種技術(shù)人工使所述選定的植株自體受粉。一種技術(shù)是“蕾期授粉法”，該技術(shù)涉及在開花前1-2天將花粉置于未成熟的柱頭上。用鑷子小心地打開芽并將來自成熟花的花粉置于未成熟的柱頭上。另一種技術(shù)是用NaCl或CO2預(yù)處理成熟柱頭。在傳粉前使成熟柱頭暴露于15％NaCl10-15分鐘，或在傳粉前使成熟柱頭暴露于提高的CO2水平(最好是5％CO2)幾小時。
收集得到的F1種子，將所述種子培養(yǎng)成為成熟植株，然后根據(jù)芥子油苷分布型篩選所述成熟植株。選擇那些增強的芥子油苷分布型的性狀穩(wěn)定的植株進行進一步的培育。這樣的培育包括由所選定的植株產(chǎn)生近交系，或通過選擇其它農(nóng)學(xué)性狀或通過使所述性狀漸滲入其它所需的系或變種而進一步產(chǎn)生所選定的植株。用于雜交、選擇和培育十字花科(Cruciferae)新變種的策略是眾所周知的。(見Brassica Crops and Wild Allies:Biology & Breeding；S.Tsunoda等(編輯)，Japan Scientific Societies Press,Tokyo第1-354頁(1980))。
從由花藥培養(yǎng)獲得的雙單倍體植株衍生的那些植株產(chǎn)生了“瞬時近交體(instant inbreds)”，因為雙單倍體已經(jīng)在每一個基因座上是純合的。在培育中使用這些植株可以在2年內(nèi)產(chǎn)生近交系，而不是常規(guī)培育程序所需的5年(Ockendon,D.J.(1986),GENETICMANIPULATION IN PLANT BREEDING,Horn,J.等(編輯)De Gruyter,New York，第265-272頁)。這樣的系本身可以用作新的栽培品種，或作為產(chǎn)生雜種的親本。
然而，所述近交親本是難以維持的，因為它們是自交不親和的。因此，使用不同方法來克服自交不親和性系統(tǒng)。一組這樣的方法涉及產(chǎn)生種子。這些方法包括改變營養(yǎng)條件(Stout,A.B.(1931)Am J Bot18:686-695)、花粉移植(Kroh,M.(1966)(用十字花科對不親和機制的特征鑒定的貢獻)，Züchter第36卷:185-189)、破壞柱頭(Linskens,H.F.和Kroh,M.(1967)Handb Pflanzenphysiol第18卷506-530)、化學(xué)處理(Tatebe,T.(1968)J Jpn Soc Hortic Sci.37:227-230)、CO2處理(Nakanishii等(1968)Plant Cell Physiol 10:925-927)、高溫(Gonai,H.和Hinata,K.(1971)L Jpn J Breed 21:195-198)以及電處理(Roggen等(1972)L Euphytica 21:181-184)。然而，常規(guī)使用的方法是在自交不親和性起作用前對芽受粉，或“蕾期授粉法”(Wiering,D.(1958)Euphytica 7:223-227)。
然而，通過這些方法產(chǎn)生種子是艱巨并且昂貴的。第二組克服自交不親和系統(tǒng)的方法涉及無性繁殖以維持近交系。這些方法包括從植物營養(yǎng)部分(如莖、葉和肋狀外植體(rib explant))繁殖(Johnson等，(1970)Hort Sci 13:246-247)、從莖插條和整個或部分籽苗芽繁殖(Nieuwhof,M.(1969)WORLD CROPS SERIES,Hill,London)以及從根插條繁殖(North,C.(1953)Ann Appl Biol 40:250-261)。這些方法也可以用于繁殖由田間試驗選出的植株。
通過常規(guī)培育技術(shù)將增強的芥子油苷分布型的性狀漸滲入具有優(yōu)良農(nóng)學(xué)性能的系。這樣的技術(shù)包括輪回選擇(Vello等(1977)；ESALQ,Piracicaba,Brazil，第742頁；(1978)Plant Breed Abstract第48卷，第7062頁)以及通過為一致性的近交并組合近交系成為綜合系的加性遺傳變異(Honma,S.(1965)J Am Soc Hortic Sci 87:295-298)。通過培育F1雜種栽培品種，利用雜種優(yōu)勢(Legg等(1968)J Am Soc Hortic Sci 92:432-437)。使用目前在莖椰菜(calabrese)中可用的胞質(zhì)雄性不育性(cms)(Dickson,M.H.(1975)HortSci 10:535)培育雜種。
可以將同樣的培育技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)生產(chǎn)生這樣的種子的系所述種子在萌發(fā)和抽芽期間，種子物質(zhì)(特別是芥子油苷)的滲漏降低。伴隨種子物質(zhì)滲漏降低的種子萌發(fā)另一種使種子萌發(fā)和抽芽期間種子物質(zhì)(特別是芥子油苷)的滲漏最小化的方法是以一定的水對干種子的比例使種子吸漲并萌發(fā)，所述水對干種子的比例剛好足以允許所述籽苗在正常的商業(yè)化抽芽周期中的正常生長，而并不導(dǎo)致從所述籽苗的任何水流出。使種子暴露于更少量的水降低了萌發(fā)和抽芽期間種子物質(zhì)(特別是芥子油苷)從種子滲漏的量。滲漏減少導(dǎo)致芥子油苷的滯留量增加，產(chǎn)生具有增強的化學(xué)防護性質(zhì)的籽苗。此外，水體積的減少導(dǎo)致釋放的芥子油苷的濃度提高，因此增加它們在抽芽環(huán)境中的抗生素有效性。
如前所述使種子萌發(fā)，首先對它們進行表面消毒，然后使它們在正常商業(yè)化萌發(fā)和抽芽過程中暴露于一定量的水一定時期。優(yōu)選的最小水體積是允許正常生長并且不允許任何水從膨脹和抽芽的種子“流出”或滴下的水量。在一般商業(yè)實踐中，該量一般是每克干種子6ml水；也可以使用高達每克干種子15 ml的水。商業(yè)化的萌發(fā)周期一般是2-5天，并且該周期取決于所需植物種子和籽苗的類型。
實施例1雙單倍體植株的產(chǎn)生雙單倍體由Dr.Mark W.Farnham，美國農(nóng)業(yè)部，Charleston,SouthCarolina從幾個嫩莖花椰菜變種制備，所述嫩莖花椰菜變種包括珠穆朗瑪峰(Everest)、HiSierra、馬拉松(Marathon)、蘇丹(Sultan)和海盜(Viking)，如Famham,M.W.,J.AmER.Soc.Hort.Sci.123:73-77(1998)所述，該文獻通過引用結(jié)合到本文中。遵循Keller,WA(1984):CELLCULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS，第1卷(Academic Press,New York)，第302-310頁)中所述的技術(shù)，通過花藥培養(yǎng)獲得所述植株，所述技術(shù)在下面概述。
在受控制的環(huán)境條件下從種子培養(yǎng)出植株。在莖延伸之前和任何花出現(xiàn)之前，從發(fā)育中的主花序選擇芽。將所述芽表面消毒、打開、并從絲上分離下花藥。然后將所述花藥成組種植在培養(yǎng)皿中以瓊脂固化的營養(yǎng)培養(yǎng)基上。在黑暗中培育花藥直到從花藥發(fā)育出胚狀體。然后將所述胚狀體轉(zhuǎn)移到連續(xù)光照下使其變綠。
將帶有健康根系的幼小的小植株種植在盆中并在溫室中健化。隨后將所述植株種植在田中，使其發(fā)育成成熟植株。從成熟的再生植株上收獲市場階段的頭狀花序，并如下面所述測定芥子油苷含量。
實施例2篩選雙單倍體植株從雙單倍體植株(DH植株)以及從由譜系篩選程序獲得的植株(F4植株)和由雜種植株(F1植株)獲得的植株獲取組織。所述F4植株來源于通過使來自栽培品種Marathon、Everest、High Sierra和Futura的親本自交產(chǎn)生出的分離群體。各個F4植株由單一F2和F3選擇產(chǎn)生得到，所述F4植株根據(jù)園藝學(xué)特性以及尤其是嫩莖花椰菜頭狀花序質(zhì)量而作為最佳單株選擇出來。通過使或者來自有性雜交或者來自DH植株的兩親本雜交，產(chǎn)生F1雜種。
基本如以前所述測定嫩莖花椰菜頭狀花序的芥子油苷含量。然后測定每個組織樣品的烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例。
實施例3篩選結(jié)果植株的選擇篩選DH植株、F4植株和F1植株的結(jié)果顯示于表1。
表1烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例
測定了幾個嫩莖花椰菜栽培品種的烷基芥子油苷濃度對吲哚芥子油苷濃度的比例。顯示的結(jié)果包括針對幾種不同單株類型測定的比例，所述不同單株類型包括通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的雙單倍體(“DH”)；通過使或者來自有性雜交或者來自DH植株的兩親本雜交產(chǎn)生的雜種植株(“F1”)；以及得自譜系選擇程序的植株(“F4”)。這些F4植株來源于通過使來自指定栽培品種的親本植株自交而產(chǎn)生的分離群體；所測試的植株是經(jīng)過4輪自交的單株。
如可以從表1中看出的，來自兩個栽培品種的雙單倍體植株擁有顯著高于其它受測試植株中存在的烷基芥子油苷對引哚芥子油苷的比例。因此，兩株來自HiSierra的雙單倍體具有的比例比在另一株受測試植株中見到的最高值高至少20％。同樣，三株來自海盜的單株具有的比例比在另一株受測試植株中見到的最高值高至少10％。選擇這些單株進行進一步的培育。
此外，在溫室中，將來自European Sprouting Calabrese Broccoli(JHU#740)同一批種子的約100粒種子種植在Jiffy Mix中。培養(yǎng)7天后，用外科剪刀從每株小植株剪下約40％單個、擴展的子葉，并將剪下的部分立即投入-80℃的三溶劑中以進行隨后的勻漿以及離子對色譜HPLC以測定芥子油苷含量。這些樣品中的烷基芥子油苷吲哚芥子油苷比例列于表2。所述樣品顯示了約300倍范圍的烷基芥子油苷吲哚芥子油苷比例。
表2烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例
1蘿卜苷+Glucoiberin+Glucoerucin2羥基蕓苔葡糖硫苷+蕓苔葡糖硫苷+新葡糖蔓菁苷實施例4培育選定的植株如以前所述，使作為具有所需烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例而選出的雙單倍體單株自體受粉，最好是通過蕾期授粉法而自體受粉。收集后代種子或F1代并種植在田間，然后根據(jù)芥子油苷水平進行篩選。在這種情況下，收獲用于篩選的組織是市場階段的嫩莖花椰菜頭狀花序。將性狀穩(wěn)定的那些植株作為起源于單株植株的近交系維持。如以前所述，通過人工授粉或通過無性繁殖維持所述植株。
當所述近交系在農(nóng)學(xué)上可接受時，可以將該近交系直接用于生產(chǎn)市售嫩莖花椰菜頭狀花序。或者，可以用所述近交系生產(chǎn)雜種種子。優(yōu)選用于產(chǎn)生所述雜種種子的另一親本也是表達高烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的近交系。最后，可以將所述近交系用作提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的性狀的來源，所述性狀可以通過常規(guī)培育技術(shù)轉(zhuǎn)移到其它嫩莖花椰菜變種中。
實施例5具有高水平化學(xué)防護劑的植株的應(yīng)用顯示所需的芥子油苷分布型的植株(如通過提高的烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例顯示)可用于多種用途。所述植株的不同部分可以作為飲食部分而被消費。這些包括市場階段的頭狀花序、種子和籽苗。這些植株部分如果未經(jīng)加工就被直接消費，或者如果所述植株材料經(jīng)過加工并與其它食物組合使用，這些植株部分就被間接消費。因此，例如，市場階段的嫩莖花椰菜或花椰菜頭狀花序或者經(jīng)過烹飪或未經(jīng)烹飪被直接消費。
可以將種子直接加入食品中。所述種子可以用于許多不同食物，如色拉、面包和其它焙烤食品?；蛘?，將所述種子磨成粉或粗粉以用作食品或飲料添加劑。將所述粉或粗粉加入面包、其它焙烤食品或健康飲料或混合飲料(shake)?？梢詫⑺龇奂尤胨幫?、膠囊或其它可攝取的制劑。
還可使所述種子發(fā)芽以產(chǎn)生同樣用于多種用途的籽苗?？梢詫⑺鲎衙缌⒓醇尤胧称?，如新鮮的色拉、三明治或飲料?？梢允顾鲎衙缑撍⒓尤胨幫?、膠囊或食品添加劑?；蛘?，制備所述籽苗的無毒溶劑提取物用于制成湯、茶等。一般在無營養(yǎng)的固體支持物上、并且常常是在適于運輸和銷售的容器中培養(yǎng)籽苗。通常在二葉期(第一對真葉)或更早收獲所述籽苗。在種子萌發(fā)后，根據(jù)生長溫度和其它非生物因子，培養(yǎng)所述籽苗1到20天，然后在二葉期或更早收獲所述籽苗。
所述種子或籽苗的無毒溶劑提取物可用作有益健康的浸劑或湯。使用無毒溶劑提取所述種子以制備湯、茶或其它飲料和浸劑。用冷水、溫水、或最好是熱水或沸水提取所述籽苗。如果需要，在提取后，可以除去殘留在所述提取物內(nèi)的種子或籽苗殘余物。所述提取物可以直接攝取，或可以對其進行進一步的處理。例如，可以將其蒸發(fā)以產(chǎn)生干燥的提取制品?？梢詫⑵淅鋮s、冷凍或凍干?？梢詫⑵渑c含有有活性的黑芥子酶的十字花科植物蔬菜混合。這將在攝取前快速將芥子油苷轉(zhuǎn)化成異硫氰酸酯。含有有活性的黑芥子酶的合適蔬菜是蘿卜屬(Raphanus)，尤其是日本蘿卜，即一種蘿卜。
實施例6高水平芥子油苷以及它們的異硫氰酸酯同類物在種子和籽苗瀝濾液中的展示根據(jù)籽苗工業(yè)普遍接受的方法，將約600g嫩莖花椰菜種子和苜蓿種子浸入含25％商業(yè)化漂白制備物(例如Clorox)的水溶液消毒15分鐘后，將它們置于商業(yè)化風(fēng)格的盤型發(fā)芽車(sprout cart)上分開但臨近的盤上，然后用水徹底清洗所述種子。然后將所述種子置于傾斜的發(fā)芽盤上，用上方彌霧噴嘴的噴霧再次清洗，然后使其靜置1小時，在此之后經(jīng)由上方的霧傳遞水直到每發(fā)芽盤約流出并收集約200ml液體。使用每小時六次20秒噴霧繼續(xù)噴霧直到下一個收集時期，此時再次靜置所述盤1小時，然后用新鮮的水清洗下瀝濾液并收集所述瀝濾液。分析所述瀝濾液(該瀝濾液在pH6.8呈淡黃色)中存在的芥子油苷的量和類型。
在來自嫩莖花椰菜種子和籽苗的水/清洗水(統(tǒng)稱為“瀝濾液”)中的異硫氰酸水平從種子消毒處理后第一小時培養(yǎng)后的約13μM增加到培養(yǎng)第七小時后的約192μM。蘿卜苷(1-異硫氰酸基-4R-[甲基亞硫?；鵠丁烷的前體)的水平在第七小時達到約0.33mM，并且回收的芥子油苷包含99.4％蘿卜苷和0.6％新葡糖蔓菁苷。與此相比，在以同樣方式處理的苜蓿種子/籽苗中沒有這些化合物的蹤跡。
來自每小時嫩莖花椰菜瀝濾液收集物的總?cè)芙夤腆w(干重)的回收率在3.9mg/ml到5.2mg/ml之間。來自所述種子的蘿卜苷的總回收率高達81.5nmol/g種子/小時。如果瀝濾持續(xù)半天，則它含約1μmol蘿卜苷或包含在這些實驗中使用的種子中總蘿卜苷含量的約20％。
實施例7嫩莖花椰菜種子和籽苗瀝濾液對細菌生長的生長抑制效應(yīng)如實施例6中所述制備的瀝濾液對于大腸桿菌菌株DH10B在肉湯培養(yǎng)基中的生長有有力的抑制效應(yīng)。在使用從多種籽苗制備物收集到的瀝濾液完成的多個實驗中觀察到這種效應(yīng)。1．來自已萌發(fā)的嫩莖花椰菜和苜蓿的種子/籽苗的瀝濾液對細菌在正常營養(yǎng)培養(yǎng)基和低營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長的效應(yīng)在完全Luria肉湯(“1X LB”，一種培養(yǎng)這樣的微生物的標準培養(yǎng)基)以及低營養(yǎng)培養(yǎng)基(或0.1X LB)上監(jiān)測細菌生長。通過將干成分(對于全強度的培養(yǎng)基，是10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物以及10g/LNaCl)加入合適體積的瀝濾液中，制備培養(yǎng)基，所述瀝濾液來自如實施例6中所述消毒種子后制備的收集物。一旦溶解了干的1X或0.1 LB成分，用NaOH將pH調(diào)到pH 7.5，然后對所述培養(yǎng)基進行過濾除菌并用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌。
嫩莖花椰菜籽苗瀝濾液具有切實的抑制效應(yīng)。驚人的是，這種效應(yīng)甚至在低營養(yǎng)培養(yǎng)基背景(0.1X LB)中更顯著，而該背景實際上更代表抽芽過程期間存在的實際“營養(yǎng)條件”(圖1)。與此相比，從苜蓿籽苗獲得的瀝濾液沒有觀察到抑制效應(yīng)。雖然初始試驗表明嫩莖花椰菜籽苗瀝濾液的這種生長抑制活性在凍干以及加熱到50℃時是穩(wěn)定的，但在與瓊脂基質(zhì)混合時該活性看起來迅速喪失。2．在萌發(fā)期間的不同時間從嫩莖花椰菜種子/籽苗獲得的瀝濾液對細菌生長的效應(yīng)如實施例6中所述制備瀝濾液，并如實施例7.1.所述監(jiān)測大腸桿菌在0.1X LB上的生長。用在嫩莖花椰菜種子萌發(fā)第一小時、第四小時和第七小時后收集到的瀝濾液制備0.1X LB。
嫩莖花椰菜種子/籽苗瀝濾液對細菌生長有有力的抑制效應(yīng)，該效應(yīng)隨著萌發(fā)的時間而增加(圖2)。差異性效果與瀝濾液的異硫氰酸酯含量和芥子油苷-異硫氰酸酯含量軼相關(guān)(圖3)，并且該效應(yīng)在嫩莖花椰菜籽苗生長的第三天消失。如實施例6中一樣，苜蓿種子瀝濾液對細菌生長有刺激效應(yīng)(用第7小時的瀝濾液觀察到最終細菌滴度增加34％)。沒有一種苜蓿籽苗瀝濾液顯示對細菌的任何生長抑制效應(yīng)(圖4)。3．來自萌發(fā)后4小時和7小時的嫩莖花椰菜種子/籽苗瀝濾液(匯集)對葡萄球菌屬物種生長的效應(yīng)金黃色葡萄球菌和一種未鑒定的葡萄球菌屬物種的生長被來自萌發(fā)后4小時和7小時的嫩莖花椰菜種子/籽苗瀝濾液(匯集)的25％稀釋液抑制50％，所述瀝濾液如實施例6中所述收集。在半固體(瓊脂)基質(zhì)中，使用Tripticase Soy(高蛋白生長培養(yǎng)基)以及標準的最小抑制濃度測定系統(tǒng)進行這些測試。由于抗生素活性看起來在基于瓊脂的測試系統(tǒng)中迅速喪失，這些結(jié)果可能代表這些化合物可能的生長抑制效應(yīng)范圍的下界。
雖然上面的描述提及具體的優(yōu)選實施方案，但應(yīng)當理解本發(fā)明并不是如此有限的。對于那些本領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)人員來說，對于所公開的實施方案可以作出各種修改，并且這樣的修改處于由下面的權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本說明書中提到的所有出版物和專利申請指示出本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的水平。
所有出版物和專利申請通過引用結(jié)合到本文中，就如同明確和單獨地指出每個單獨的出版物或?qū)＠暾埗纪ㄟ^引用完整地結(jié)合的同等程度。
權(quán)利要求
1．選擇植物的方法，包括(a)測定一株植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，然后(b)如果該比例是特定數(shù)值，則選擇該植株。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述植株是雙單倍體植株。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述雙單倍體植株通過花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述植株是誘變處理的植株。
5．權(quán)利要求4的方法，其中在(a)前用化學(xué)誘變劑誘變處理所述植株。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述化學(xué)誘變劑是甲基磺酸乙酯。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述植株是十字花科植物。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述植株是嫩莖花椰菜植株。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述植株屬于由以下選出的栽培品種Saga、DeCicco、珠穆朗瑪峰(Everest)、翡翠城(Emerald City)、Packman、Corvet、Dandy Early、皇帝(Emperor)、Mariner、綠彗星(GreenComet)、Green Valiant、Arcadia、Calabrese Caravel、Chancellor、Citation、巡洋艦(Cruiser)、早紫萌芽紅箭(Early Purple Sprouting,Red Arrow)、Eureka、Excelsior、大帆船(Galleon)、Ginga、Goliath、綠公爵(GreenDuke)、綠色地帶(Greenbelt)、意大利萌芽(Italian Sprouting)、HiSierra、晚紫萌芽(Late Purple Sprouting)、晚冬萌芽白星(Late Winter SproutingWhite Star)、Legend、Leprechaum、馬拉松(Marathon)、水手(Mariner)、Minaret (Romanesco)、杰出典范(Paragon)、愛國者(Patriot)、PremiumCrop、Rapine(Spring Raab)、Rosalind、Salade(Fall Raab)、武士(Samurai)、Shogun、短跑選手(Sprinter)、蘇丹(Sultan)、Taiko、和Trixie、以及海盜(Viking)。
10．權(quán)利要求8的方法，其中所述植株屬于由以下選出的栽培品種海盜(Viking)、珠穆朗瑪峰(Everest)、HiSierra和馬拉松(Marathon)。
11．權(quán)利要求7的方法，其中所述植株是花椰菜植株。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述植株屬于由以下選出的栽培品種Alverda、Amazing、Andes、勃艮第王后(Burgundy Queen)、CandidCharm、Cashmere、圣誕白(Christmas White)、Dominant、Elby、雪球(Snowball)以及雪球的選擇物、Fremont、Incline、Milkyway Minuteman、Rushmore、S-207、Serrano、Sierra Nevada、Siria、雪冠(Snow Crown)、雪片(Snow Flake)、Snow Grace、Snowbred、Solide、Taipan、紫羅蘭王后(Violet Queen)、白男爵(White Baron)、白主教(White Bishop)、WhiteContessa、白暈(White Corona)、白鴿(White Dove)、白色閃光(WhiteFlash)、白狐(White Fox)、白騎士(White Knight)、白光(White Light)、白王后(White Queen)、白巖(White Rock)、白帆船(White Sails)、白夏(White Summer)、白頂(White Top)、和Yukon。
13．產(chǎn)生后代植株的方法，所述方法包括(a)測定一株有潛力的親本植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，然后(b)如果該比例是特定數(shù)值，則選擇該有潛力的親本植株，并(c)從所選定的植株產(chǎn)生后代植株。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述后代植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例高于所述選定植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，并且其中所述后代植株的所述組織與所述選定植株的所述組織是同一類型。
15．通過權(quán)利要求13的方法產(chǎn)生的后代植株，其中所述后代植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例高于所述選定植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例，并且其中所述后代植株的所述組織與所述選定植株的所述組織是同一類型。
16．權(quán)利要求15的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例至少大10％。
17．權(quán)利要求16的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例至少大20％。
18．權(quán)利要求17的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例至少大30％。
19．權(quán)利要求18的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例至少大50％。
20．權(quán)利要求19的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例至少大100％。
21．權(quán)利要求20的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例是所述選定植株的所述組織中的所述比例的至少10倍。
22．權(quán)利要求21的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例是所述選定植株的所述組織中的所述比例的至少100倍。
23．權(quán)利要求16的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例大10％到100％。
24．權(quán)利要求23的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例大20％到80％。
25．權(quán)利要求24的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例比所述選定植株的所述組織中的所述比例大30％到60％。
26．權(quán)利要求21的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例是所述選定植株的所述組織中的所述比例的10倍到100倍。
27．權(quán)利要求26的后代植株，其中所述后代植株的所述組織中的所述比例是所述選定植株的所述組織中的所述比例的25倍到75倍。
28．權(quán)利要求15的后代植株，其中后代所述植株通過使所述選定的植株自交而產(chǎn)生。
29．權(quán)利要求15的后代植株，其中所述后代植株是雜種植株。
30．十字花科植物的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于6。
31．權(quán)利要求30的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于10。
32．權(quán)利要求31的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于25。
33．權(quán)利要求32的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于50。
34．權(quán)利要求33的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于100。
35．權(quán)利要求34的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例大于1000。
36．權(quán)利要求30的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例在6到1000之間。
37．權(quán)利要求36的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例在10到500之間。
38．權(quán)利要求37的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例在25到250之間。
39．權(quán)利要求38的植株，其中所述植株的一種組織中烷基芥子油苷對吲哚芥子油苷的比例在50到100之間。
40．權(quán)利要求30的植株，其中所述植株是嫩莖花椰菜植株。
41．權(quán)利要求30的植株，其中所述植株是花椰菜植株。
42．選擇種子或籽苗的方法，所述方法包括(a)向種子或籽苗加一定量的水，(b)測定所述種子或籽苗的瀝濾液中一種芥子油苷的濃度，然后(c)假如該濃度是一個特定值，則選定所述種子或籽苗。
43．產(chǎn)生后代植株的方法，所述方法包括(a)向種子或籽苗加一定量的水，(b)測定所述種子或籽苗的瀝濾液中一種芥子油苷的濃度，(c)假如該濃度是一個特定值，則選定所述種子或籽苗，然后(d)由所述選定的種子或籽苗產(chǎn)生后代植株。
44．在能夠維持微生物生長的環(huán)境中抑制微生物生長的方法，所述方法包括以抑制微生物生長的量給予所述環(huán)境十字花科種子瀝濾液或十字花科籽苗瀝濾液。
45．權(quán)利要求44的方法，包括以抑制微生物生長的量給予所述環(huán)境十字花科籽苗瀝濾液。
46．權(quán)利要求44的方法，其中所述方法防止微生物生長。
47．權(quán)利要求44的方法，其中所述微生物是一種細菌。
48．權(quán)利要求44的方法，其中所述微生物是埃希氏菌屬物種。
49．權(quán)利要求44的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。
50．權(quán)利要求44的方法，其中所述微生物是葡萄球菌屬物種。
51．權(quán)利要求44的方法，其中所述微生物是金黃色葡萄球菌。
52．權(quán)利要求44的方法，其中所述瀝濾液是嫩莖花椰菜瀝濾液。
53．權(quán)利要求44的方法，其中所述瀝濾液是花椰菜瀝濾液。
54．權(quán)利要求44的方法，其中所述瀝濾液含有芥子油苷。
55．制備籽苗的方法，所述方法包括(a)提供一定量的種子，(b)向所述種子加每g種子0.6到1.0g的水，(c)使所述加水的種子萌發(fā)并形成籽苗，然后(d)向所述籽苗加每株籽苗每24小時5到9mg之間的水直至24到120小時，由此制備所述籽苗。
56．權(quán)利要求55的方法，其中(b)包括向所述種子加每g種子0.7到0.9g的水。
57．權(quán)利要求55的方法，其中(b)包括向所述種子加每g種子0.8g的水。
58．權(quán)利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小時6到8mg之間的水直至24到120小時。
59．權(quán)利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小時7mg的水直至24到120小時。
60．權(quán)利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小時5到9mg之間的水直至48到96小時。
61．權(quán)利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小時7mg的水直至72小時。
62．權(quán)利要求55的方法，其中所述籽苗是十字花科植物的籽苗。
63．權(quán)利要求55的方法，其中所述籽苗是嫩莖花椰菜籽苗。
64．權(quán)利要求55的方法，其中所述籽苗是花椰菜籽苗。
全文摘要
產(chǎn)生具有高水平癌癥化學(xué)防護劑的十字花科植物種質(zhì)(尤其是嫩莖花椰菜種質(zhì)和花椰菜種質(zhì))的方法,包括根據(jù)芥子油苷分布型篩選植株群體,并選擇具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的單株。用所選定的植株的隨后培育產(chǎn)生具有所需芥子油苷分布型的變種、系以及植株。通過以限制的水體積萌發(fā)種子,培養(yǎng)十字花科植物的籽苗以增強所述籽苗的化學(xué)防護活性的方法。產(chǎn)生十字花科植物種質(zhì)的方法,所述十字花科植物種質(zhì)產(chǎn)生種子物質(zhì)滲漏降低的種子,所述方法包括根據(jù)產(chǎn)生滲漏降低的種子篩選植株群體并選擇產(chǎn)生這樣的種子的單株。
文檔編號C12N15/09GK1314781SQ99810066
公開日2001年9月26日 申請日期1999年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月1日
發(fā)明者J·W·費伊 申請人:約翰斯霍普金斯醫(yī)學(xué)院