利用級(jí)聯(lián)的dna鏈替換反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)非編碼rna檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞內(nèi)非編碼RNA分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用級(jí)聯(lián)的DNA 鏈替換反應(yīng)有效的釋放具有熒光基團(tuán)修飾的信號(hào)鏈分子，從而實(shí)現(xiàn)非編碼RNA，尤其是 microRNA(miRNA)的檢測(cè)。 技術(shù)背景
[0002] 在人體組織以及細(xì)胞中存在一些不翻譯成蛋白，但是具有重要作用的RNA分子， 我們稱之為非編碼RNA。例如人體細(xì)胞中不可或缺的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)， 還有一些表達(dá)量相對(duì)較低的snoRNA,microRNA,siRNA,snRNA,exRNA,piRNA和longncRNA。 其中MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子。由于miRNA能夠很好的識(shí)別并配對(duì)后轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)而調(diào)控蛋白的表達(dá)，所以它與動(dòng)物 體內(nèi)的生物過(guò)程息息相關(guān)。目前已經(jīng)有研宄表明：miRNA的異常行為會(huì)導(dǎo)致疾病的出現(xiàn)，包 括心血管疾病，神經(jīng)發(fā)育失常，甚至癌癥。[Nature，2012, 482, 347.]所以在癌癥的診斷以及 治療過(guò)程中miRNA的濃度都是一個(gè)重要的生物指標(biāo)。
[0003] 目前為止，通用的miRNA檢測(cè)方法包括：Northern Blotting, miRNA微陣列，和 qRT-PCR。[Chem. Rev.，2013, II3, 6207.]其中Northern Blotting是最經(jīng)典的miRNA檢測(cè) 手段，但是它本身檢測(cè)靈敏度較低，并且需要大量的樣品。而miRNA微陣列具有高通量檢測(cè) 的優(yōu)勢(shì)，但是檢測(cè)需要的時(shí)間很長(zhǎng)，并且精度不高。qRT-PCR檢測(cè)手段具有高精度，高靈敏 度的特點(diǎn)，但是需要長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增步驟并且對(duì)操作人員具有一定的技能要求，這在實(shí)時(shí)檢 測(cè)中是一個(gè)很大的問題。但是上述方法最大的一個(gè)問題是所有的實(shí)驗(yàn)都是基于細(xì)胞裂解處 理，無(wú)法實(shí)時(shí)的反映出細(xì)胞內(nèi)部真實(shí)的miRNA的作用機(jī)制。
[0004] 然而為了能更加深入了解miRNA在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的真實(shí)信息以及探索 miRNA在細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的miRNA的檢測(cè)則尤為重要?，F(xiàn)如今體內(nèi) miRNA檢測(cè)手段主要分為原位雜交技術(shù)和動(dòng)態(tài)成像技術(shù)。在動(dòng)態(tài)成像技術(shù)中基于分子信標(biāo) 成像是一個(gè)非常重要的手段。借助特殊的轉(zhuǎn)染技術(shù)將熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，分 子信標(biāo)與目標(biāo)miRNA分子配對(duì)后發(fā)生結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)的出現(xiàn)，最終實(shí)現(xiàn)miRNA 的檢測(cè)。[Biomaterials，2012, 33, 6430.]但是這些技術(shù)中存在一個(gè)明顯的問題就是每次的 信號(hào)分子的輸出都伴隨著目標(biāo)分子的消耗。而在細(xì)胞中的miRNA分子表達(dá)非常的有限，所 以上述的技術(shù)在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA分子的檢測(cè)具有很大的限制。
[0005] 因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞內(nèi)miRNA分子檢測(cè)的困難，本發(fā)明人進(jìn)行了深入 研宄，發(fā)現(xiàn)利用級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)microRNA檢測(cè)具有簡(jiǎn)單操作，可以實(shí)現(xiàn) 低濃度檢測(cè)等特點(diǎn)，在現(xiàn)有的技術(shù)文獻(xiàn)的進(jìn)一步檢索中沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反 應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)方法。該檢測(cè)手段無(wú)需嚴(yán)格 的操作條件，操作簡(jiǎn)單。在該新的組裝方法中首次將級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)應(yīng)用到細(xì)胞內(nèi)microRNA檢測(cè)。其原理見圖1，首先在DNA分子探針的制備中需要先將基底鏈與信號(hào)鏈雜 交。在這種情況下信號(hào)鏈末端的熒光基團(tuán)（例如FAM)會(huì)與基底鏈末端的淬滅基團(tuán)（例如 BHQ-1)非常的靠近，熒光基團(tuán)被淬滅，沒有信號(hào)的輸出。需要導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的DNA分子探針 中除了上述的雙鏈DNA，同時(shí)也包括一條"燃料鏈"。分子探針導(dǎo)入到細(xì)胞以后，目標(biāo)miRNA 序列首先與雙鏈DNA上的裸露的一端作用，進(jìn)而發(fā)生鏈替換反應(yīng)，釋放出信號(hào)鏈分子。該反 應(yīng)的中間產(chǎn)物與"燃料鏈"分子發(fā)生鏈替換反應(yīng)，釋放出miRNA。經(jīng)過(guò)上述的級(jí)聯(lián)的DNA鏈替 換反應(yīng)，信號(hào)鏈被釋放，而且miRNA鏈得到有效的回收，能夠用于觸發(fā)新的一輪的反應(yīng)。該 發(fā)明充分利用了級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)在信號(hào)放大上的能力，最終實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)miRNA分 子的檢測(cè)。
[0007] 具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)：
[0008] 本發(fā)明一方面提供一種DNA分子探針組合，所述DNA分子探針組合包括雙鏈DNA 寡核苷酸和單鏈DNA寡核苷酸兩部分，所述雙鏈DNA寡核苷酸由一端帶有焚光基團(tuán)修飾的 信號(hào)鏈與一端修飾有淬滅基團(tuán)的基底鏈按照1:1的比例雜交而成，并且基底鏈比信號(hào)鏈在 未修飾淬滅基團(tuán)端多5個(gè)堿基，形成裸露端。
[0009] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述熒光基團(tuán)修飾在信號(hào)鏈的5'端，所述淬滅基團(tuán)修飾在 基底鏈的3'端，相應(yīng)的，基底鏈在5'端多出5個(gè)堿基，形成裸露端。
[0010] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述熒光基團(tuán)為FAM或Cy5,淬滅基團(tuán)為BHQ-1或BHQ-2。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物體內(nèi)非編碼RNA分子的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0012] 1)根據(jù)待測(cè)非編碼RNA分子設(shè)計(jì)互補(bǔ)的信號(hào)鏈和基底鏈，以及與基底鏈部分互補(bǔ) 的單鏈DNA分子，S卩燃料鏈，其中，待測(cè)非編碼RNA分子與基底鏈部分互補(bǔ)，且信號(hào)鏈在一端 修飾有熒光基團(tuán)，基底鏈在一端修飾有淬滅基團(tuán)，并且基底鏈比信號(hào)鏈在未修飾淬滅基團(tuán) 端多5個(gè)堿基，形成裸露端；
[0013] 2)將互補(bǔ)的信號(hào)鏈和基底鏈按照1:1的比例雜交形成雙鏈；
[0014] 3)將步驟2)中形成的雙鏈與所述燃料鏈一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞；
[0015] 4)成像并觀察。
[0016] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述熒光基團(tuán)修飾在信號(hào)鏈的5'端，所述淬滅基團(tuán)修飾在 基底鏈的3'端，相應(yīng)的，基底鏈在5'端多出5個(gè)堿基，形成裸露端。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述信號(hào)鏈的長(zhǎng)度比被檢測(cè)非編碼RNA，尤其是miRNA短 1-2個(gè)堿基。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述燃料鏈的長(zhǎng)度比被檢測(cè)非編碼RNA，尤其是miRNA長(zhǎng) 1-2個(gè)堿基。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述部分互補(bǔ)是指除去末端多出的堿基，其余部分完全互 補(bǔ)。
[0020] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非編碼RNA分子為miRNA，優(yōu)選為miRNA-21、 miRNA-122〇
[0021] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)于miRNA-21，所述DNA分子探針組合中，所述 基底鏈序列為BHQ-1-CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDN0:1)，所述信號(hào) 鏈的序列為TATCAGACTGATGTTGATTGG-FAM(SEQIDNO:2)，所述燃料鏈的序列為CTTATCAGACTGATGTTGATTGG(SEQIDNO：3)〇
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)于miRNA-122,所述DNA分子探針組合中，所述 基底鏈的序列為BHQ-2-CTACCAAACACCAITGTCACACTCCA(SEQIDNO:4)，所述信號(hào) 鏈的序列為TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQIDNO:5)，所述燃料鏈的序列為 AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQIDNO：6)〇
[0023] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供所述DNA分子探針組合用于靶分子及靶分子所在細(xì)胞 在生物體內(nèi)成像的用途。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，優(yōu)選為Huh7細(xì)胞。
[0025] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶分子為非編碼RNA分子，優(yōu)選為miRNA分子，更優(yōu)選 為miRNA-21、miRNA-122。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種非編碼RNA分子的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含所 述DNA分子探針組合。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供試劑盒，所述試劑盒包含所述DNA分子探針組合。
[0028] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶分子為非編碼RNA分子，優(yōu)選為miRNA分子，更優(yōu)選 為miRNA-21、miRNA-122。
[0029] 本發(fā)明提供如下方案和技術(shù)效果：
[0030] 〈1〉.合理設(shè)計(jì)DNA分子探針，使細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)鏈能夠觸發(fā)級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng) 的發(fā)生，，進(jìn)而有效的釋放具有熒光基團(tuán)修飾的信號(hào)鏈，通過(guò)熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞的成 像，最終實(shí)現(xiàn)基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)。
[0031] 〈2〉.根據(jù)〈1>所述的基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)的方法， 其特征在于設(shè)計(jì)了一種特殊的DNA分子探針。該分子探針包含兩部分：首先是一種特殊的 雙鏈DNA，該雙鏈由帶有熒光基團(tuán)（例如：FAM)修飾的信號(hào)鏈與末端修飾有淬滅基團(tuán)（例如 BHQ-1)的基底鏈雜交而成；另一部分則是稱為"燃料鏈"的單鏈DNA。
[0032] 〈3〉.根據(jù)〈1>所述的基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)的方法， 其特征在于設(shè)計(jì)的DNA分子探針能在細(xì)胞內(nèi)miRNA分子存在的條件下發(fā)生級(jí)聯(lián)的DNA鏈替 換反應(yīng)。
[0033] 〈4〉.根據(jù)〈1>所述的基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)的方法， 其特征在于利用級(jí)聯(lián)的鏈替換反應(yīng)釋放有熒光標(biāo)記的DNA信號(hào)鏈，實(shí)現(xiàn)腫瘤Huh7細(xì)胞的成 像。
[0034] 〈5〉.根據(jù)〈1>所述的基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)的方法， 其特征在于通過(guò)腫瘤細(xì)胞的成像可以達(dá)到miRNA-21的檢測(cè)的目的。
[0035] 〈6〉.根據(jù)〈1>所述的基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)的方法， 其特征在于該檢測(cè)方法適用于其他細(xì)胞或者組織內(nèi)各種類型的miRNA序列的檢測(cè)，同時(shí)也 適用于生物體內(nèi)各種非編碼RNA分子的檢測(cè)。另外一方面，包含有這些RNA分子的目標(biāo)鏈 的細(xì)胞或者組織的成像能在該技術(shù)下得以實(shí)行。
[0036]本發(fā)明是首次利用級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA檢測(cè)。本發(fā)明是一種 全新的miRNA分子檢測(cè)手段，該檢測(cè)手段無(wú)需嚴(yán)格的操作條件，操作簡(jiǎn)單。特別是在miRNA 分子低表達(dá)的細(xì)胞或者組織中具有非常好的優(yōu)勢(shì)。解決了在之前的檢測(cè)技術(shù)中存在檢測(cè)體 系中信號(hào)分子輸出中伴隨著目標(biāo)鏈損失的巨大困難。檢測(cè)的范圍也適用于其他類型的非編 碼RNA分子。同樣該技術(shù)也是細(xì)胞以及其他組織成像中的一種重要手段。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)