進 行雙酶切，PGEX-KG 空載體為 5. OKbp，TABl 為 1514bp ;pET-32a 空載體為 5. 9Kbp，ρ38 α 為 1197bp。從圖1可以看出，酶切后條帶大小與目的片段大小相符，結果說明目的片段TABl 和ρ38α成功插入載體中。
[0109] 2. 2序列比對結果
[0110] pGEX-KG-TABl和pET-32a_p38 α重組質(zhì)粒送北京天一輝遠公司測序，測序結果與 TABl和ρ38 α序列進行比對，均為100%匹配，測序結果證明兩個質(zhì)粒構建成功。
[0111] 實施例2融合蛋白的純化
[0112] 1、常用試劑的配制
[0113] 1)NETN Lysis Buffer ：2mM PMSF,5mM Benzamidine,ImM DTT,ImM Aprotinin,ImM Leupeptine，去離子水定容。
[0114] 2) NETN Buffer :20mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOOmM NaCl，ImM EDTA，0. 5% NP-40,臨 用前加入1% PMSF，去離子水定容。
[0115] 3)純化蛋白洗脫緩沖液（GST Elution Buffer) :50mM Tris-HCl (pH8.0)，20mM Glutathione，去離子水定容。
[0116] 4)1^8-甘氨酸電泳緩沖液：25111111〇1/11^8堿，25〇111111〇1/1甘氨酸（電泳級）， 0.1 % SDS，可配成5 X貯存液備用。
[0117] 5)考馬斯亮藍染液（IL):考馬斯亮藍R2502.0g，考馬斯亮藍G2500. 5g，甲醇 50ml，乙醇425ml，冰醋酸100ml，雙蒸水定容至1L。
[0118] 6)考染脫色液（IL):冰醋酸100ml，乙醇200ml，雙蒸水700ml。
[0119] 其他常用試劑的配制同前所述。
[0120] 2、GST融合蛋白純化方法
[0121] 2. 1收集菌液并裂解菌體
[0122] (1)將第一部分構建成功的pGEX-KG-TABl重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Rosetta中；
[0123] (2)挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)移至5ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37 °C過夜震蕩；
[0124] (3)將菌液轉(zhuǎn)移至200ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中；
[0125] (4)搖菌至 0D600nm ~ 0. 4,加入 IPTG(終濃度 0. 2mM) 16°C誘導過夜；
[0126] (5) 5000rpm 離心 IOmin 收集菌液，用 10ml NETN Lysis Buffer 重懸，加入 Iml 混 有溶菌酶的NETN Buffer，置冰上30~60min ;
[0127] (6)冰上超聲破碎菌體。
[0128] 2. 2GSH beads 結合
[0129] (1)將混有菌體的裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，4°C 1000 rpm離心lh，期間，將GSH beads (購自sigma)用PBS溶液置冰上溶脹30min，然后加 Iml NETN BufTer，6000rpm離心 30s以清洗beads，重復2次；
[0130] (2)裂解的上清轉(zhuǎn)移至另一個離心管，加入500 μ1 GSH-beads，4°C搖晃令其吸附 蛋白lh。2500rpm，離心30s后棄上清；
[0131] (3)用 20ml 冰冷的 NETN Buffer (加 1 % 的 PMSF)洗 beads 3 次，3200rpm 離心 Imin棄上清（最后一次盡量去除所有上清）；
[0132] 2. 3 洗脫
[0133] 加入 500ul 新鮮配制的 GST Elution Buffer，4°C輕搖 20min 后 2500rpm離心 30s， 收集上清，重復1次。
[0134] 2. 4 濃縮
[0135] 將上清加入超濾管，用無菌PBS置換溶劑。用Loading tip槍尖分裝到高壓過的 EP管中，20 μ 1/管，_80°C保存。
[0136] 2. 5檢測蛋白純度
[0137] (1)將純化的融合蛋白分別以不同的上樣量進行SDS-PAGE
[0138] (2)用考馬斯亮藍對SDS聚丙烯酰胺凝膠進行染色以檢測蛋白純度。
[0139] 3、His融合蛋白純化方法
[0140] 3. 1收集菌液并裂解菌體方法同前。
[0141] 收集細菌后，與前面的區(qū)別為用IOml PBS結合緩沖液（20mM的磷酸鹽緩沖液，含 500mM NaCl)重懸細菌。
[0142] 3. 2固定Ni2+離子親和色譜法
[0143] (1)結合菌體裂解后1000 Orpm離心30min，取上清過鎳柱，檢測A280,直至A280值 小于0. 01
[0144] (2)洗脫用IOmM的洗脫緩沖液（結合緩沖液加 IOmM咪唑）洗柱子，流速為l_2ml/ min，lml/管收集洗脫液，監(jiān)測A280 ;為了得到更好的His融合蛋白，分別用50mM，lOOmM， 150mM不同濃度咪唑的洗脫緩沖液分階段洗柱子，監(jiān)測A280 ;
[0145] (3)超濾合并洗脫液，4°C，6000rpm離心，超濾濃縮；測蛋白濃度并進行SDS-PAGE， 考馬斯亮藍染色確定條帶。
[0146] 4、結果
[0147] TABl蛋白分子量為56KDa，GST標簽分子量為26KDa，故GST融合蛋白的分子量應 為82KDa。由圖2可知，蛋白條帶大致正確，表明GST融合蛋白純化分離成功，用于下一部分 的實驗。
[0148] ρ38 α分子量大小為38KDa，His標簽分子量為28KDa，故His融合蛋白的分子量應 為66KDa。由圖3可知，蛋白條帶大致正確，表明His融合蛋白純化分離成功，用于下一部分 的實驗。
[0149] 實施例3 ρ38α拮抗肽突變體對ΤΑΒ1/ρ38α相互結合的阻斷作用
[0150] 1、ρ38α拮抗肽突變體
[0151] ΡΤ1、ΡΤ5、ΡΤ5-1、ΡΤ5-2、ΡΤ5-3、ΡΤ5-4、ΡΤ5-5、ΡΤ5-6 由 Chinese P印tide Company 合成，肽的純度均為95%以上。其中PTl是無功能的對照肽，實驗中作為陰性對照；PT5是 先前工作獲得的ρ38 α拮抗肽，在實驗中作為陽性對照。PT5-1~PT5-6為設計的PT5的突 變體。所有的肽均使用無菌注射用水按lmg/ml溶解，50 μ 1/管分裝保存于-20°C，避免反 復凍融。
[0152] PT5-1 突變體為 Gln3-Ala3, PT5-2 突變體為 Ser6Asn7-Ala6Ala7, PT5-3 突 變體為 Val5Asn7-Ala5Ala7, PT5-4 突變體為 Lys9Serici-Ala9Alaici, PT5-5 突變體為 ThrllAsp12-Ala11Ala12, PT5-6 突變體為 Glu13Gln14-Ala13Ala14,氨基酸序列如下：
[0153] PTl ： Ser-Ser-Ala-Gln-Ser-Thr-Ser-Arg-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Ser-Ser(SEQ ID NO. 1)；
[0154] PT5 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser(SEQ ID NO. 2)；
[0155] PT5 突變體：
[0156] PT5-1 ：Gln-Gly-Ala-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 3)；
[0157] PT5-2 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 4)；
[0158] PT5-3 ：Gln-Gly-Gln-Val-Ala-Ser-Ala-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 5)；
[0159] PT5-4 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Ala-Ala-Thr-Asp-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 6)；
[0160] PT5-5 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Ala-Ala-Glu-Gln-Ser (SEQ ID NO. 7)；
[0161] PT5-6 ：Gln-Gly-Gln-Val-Val-Ser-Asn-Gly-Lys-Ser-Thr-Asp-Ala-Ala-Ser (SEQ ID NO. 8) 〇
[0162] 注：標有下劃線部位為突變位點。
[0163] 2、方法
[0164] 2. lGST-pull down
[0165] (1)向 NETN buffer 中加入抑制因子，PMSF ImM，Aprotinin 10 μ g/ml，DTTlmM， Na3VO4ImM(抑制因子均購自Sigma公司）；
[0166] (2) His_p38 α 和 GST-TABl 溶于含抑制因子的 NETN buffer 中；
[0167] (3)加入ρ38 α拮抗肽使之終濃度為50 μ M，4°C混旋2h ;
[0168] (4)加入 GSH Sarpharose beads，4°C繼續(xù)混旋 Ih ;
[0169] (5)用含 PMSF ImM 的 NETN buffer 洗 beads 3 次，每次 NETN buffer 1ml，4°C混 旋 3min ;
[0170] (6)最后一次洗完后吸凈液體，向珠子中加入2X蛋白上樣緩沖液（loading buffer)，沸水中煮IOmin后上樣。
[0171] 2. 2免疫印跡方法
[0172] (1)常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0173] (2)將膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，條件為60V，3h ;;
[0174] (3)抗體雜交：
[0175] 1)將濾膜轉(zhuǎn)移至封閉液中，室溫孵育Ih ;
[0176] 2)加抗體（一抗）：將一抗用5%的BSA 1:1000稀釋后浸潤濾膜，封接于塑料膜 內(nèi)，放