專(zhuān)利名稱(chēng):組織蛋白酶前肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本申請(qǐng)是關(guān)于一種肽和其在治療方法中的應(yīng)用。具體而言,是關(guān)于一 種組織蛋白酶前肽、它的產(chǎn)生方法和所述前肽的應(yīng)用。
背景技術(shù):
蛋白酶是包括了大約2%的所有基因產(chǎn)物的一大群蛋白(Rawlings和 Barrett, 1999)。蛋白酶催化肽4t水解并且對(duì)于所有細(xì)胞和生物體的正常功 能是極其重要的。蛋白酶解加工事件在范圍廣泛的細(xì)胞代謝過(guò)程(cellular process)是重要的,所述過(guò)程包括骨形成、創(chuàng)傷愈合、血管發(fā)生和細(xì)胞凋 亡。
溶酶體半胱氨酸蛋白酶最初認(rèn)為是負(fù)責(zé)非選擇性降解溶酶體中蛋白 的酶。通常與溶酶體位置有關(guān),這些蛋白酶被最初認(rèn)為僅與非選擇性降解 內(nèi)涵體間隔(endosomal compartment)蛋白有關(guān)。然而,現(xiàn)在已知它們負(fù) 責(zé)許多特殊的細(xì)胞代謝過(guò)程,在抗原遞呈((Honey和Rudensky, 2003; Bryant和Ploegh, 2004 )、細(xì)胞凋亡(Zheng等,2005; Broker等,2005 )、 激素原加工(Hook等,2004 )和細(xì)胞外基質(zhì)重建(extracellular matrix remodelling) ( Chapman等,1994; Chapman等,1997)中發(fā)揮作用。組織 蛋白酶是蛋白水解酶。迄今為止,鑒定了 11種人類(lèi)組織蛋白酶,但仍需 要測(cè)定每種蛋白酶在體內(nèi)的特殊作用(Katunuma等,2003 )。組織蛋白酶 B、 L、 H、 F、 O、 X和C在多數(shù)細(xì)胞中表達(dá),提示了在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換中 的可能作用,然而組織蛋白酶S、 K、 W和V限制在特殊的細(xì)胞和組織中, 提示它們可能有更特殊的作用(Kos等,2001; Berdowska, 2004 )。組織蛋 白酶L-類(lèi)(L-like)蛋白酶(其包含CatL、 S和K)是蛋白水解酶,其屬于半胱氨酸蛋白酶的CA家族。這些溶酶體蛋白酶中的每一種都牽涉于 各種腫瘤的發(fā)展中。據(jù)認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中它們的異常高分泌導(dǎo)致細(xì)胞外基
質(zhì)(ECM)的降解。這種ECM組分(例如彈性蛋白和膠原)的異常破壞 加速了這些異常細(xì)胞對(duì)周?chē)=M織的滲透和侵入。
組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶作為失活前體產(chǎn)生,含有N末端前肽域。這 種前肽先前顯示既充當(dāng)新生蛋白酶折疊的分子伴侶又充當(dāng)活性物質(zhì)的抑 制劑,結(jié)合到未成熟溶酶體中蛋白酶的活性位點(diǎn)。抑制研究顯示CatS前肽 (CatSPP)含有對(duì)于活化的CatS的在低納摩爾范圍的抑制常數(shù)(K;),并 且可能令人驚奇地,針對(duì)CatK和CatL二者也有相似性質(zhì),盡管已顯示它 對(duì)于更低同源的CatB、 CatH或木瓜蛋白酶沒(méi)有作用。然而,CatSPP這種 性質(zhì)是獨(dú)特的,在于前肽K和L針對(duì)每種它的同族家庭成員不具有相同均 勻才中制圖(uniform inhibition profile )。
Cat S (組織蛋白酶S )從牛淋巴結(jié)和脾以及從人巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù) 克隆的人類(lèi)形式中最初鑒定(Shi等,1992)。編碼Cat S的基因位于人染 色體lq21上。由Cat S基因編碼的996堿基對(duì)轉(zhuǎn)錄物最初翻譯成具有37.5 kDa分子量的未加工前體蛋白。所述未加工蛋白主要由331個(gè)氨基酸組成 15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、99個(gè)氨基酸的前肽序列和217個(gè)氛基酸的肽。Cat S 最初與信號(hào)肽一起表達(dá),當(dāng)它進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后所述信號(hào)肽被除去。前肽序 列結(jié)合到蛋白酶活性位點(diǎn),使其失活直到它被運(yùn)輸?shù)剿嵝詢?nèi)涵體間隔之后 除去前肽序列,并且激活蛋白酶(Baker等,2003 )。
Cat S作為在主要組織相容性復(fù)合物II類(lèi)(MHC-II)中介導(dǎo)抗原遞呈的 關(guān)鍵酶被鑒定,通過(guò)抗原負(fù)載前切割恒定鏈。研究顯示Cat S缺陷型小鼠 通過(guò)APC遞呈外源蛋白的能力受損(Nakagawa等,1999) 。 Cat S在加工 恒定鏈Ii中的特異性,允許Cat S在治療例如哮喘和自身免疫性疾病等病 癥中,作為特異性的治療靶點(diǎn)(Chapman等,1997 )。
組織蛋白酶L在1988年鑒定人類(lèi)形式前最初從大鼠肝臟溶酶體中分 離(Gal和Gottesman, 1988; Joseph等,1988)。編碼CatL的基因繪圖在 人染色體9q21-22中,并且主要由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成(Fan等, I989; Chauhan等,1993)?;虍a(chǎn)物翻譯成具有39 kDa分子量的前蛋白原并且加工成2種酶活性同工型31 kDa的單鏈形式和包括24kDa重鏈以 及5 kDa輕鏈的雙鏈形式(Mason等,1989 )。前-Cat L變?yōu)槌墒旎钚悦?的加工經(jīng)由包括自催化活化法(Salminen和Gottesman, 1990 )的各種機(jī)制, 以及通過(guò)Cat D (Nishimura等,1989; Wiederanders和Kirschke, 1989 )或金 屬內(nèi)肽酶(Hara等,1988)作用發(fā)生。
Cat L有內(nèi)肽酶活性,并且優(yōu)先地切割P2和P3位間疏水性氨基酸殘 基肽鍵(K處gd等,1980, 1981 )。已顯示它以例如組織蛋白酶S相同的特 異活性水解幾種蛋白(Kirschke等,1989 )。然而,它偏愛(ài)P2位中的芳香 族殘基,使其與密切相關(guān)的組織蛋白酶S和K區(qū)分開(kāi)來(lái)(McGrath, 1999 )。
Cat L被提出在許多生物過(guò)程中具有主要作用,所述過(guò)程包括溶酶體 蛋白水解和骨吸收,以及幾種疾病例如關(guān)節(jié)炎和惡性腫瘤(Rukamp和 Powers, 2002 )。溶酶體半胱氨酸蛋白酶在抗原遞呈中的作用在過(guò)去的幾年 里被廣泛研究。Cat L通過(guò)它在皮質(zhì)的胸腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行Ii蛋白水解最 后步驟的能力牽涉于這個(gè)過(guò)程中。進(jìn)一步的證據(jù)顯示Ii鏈p41同工型有與 成熟的CatL蛋白相互作用的能力,從而在中性pH環(huán)境中穩(wěn)定它和抑制它 的活性(Ogrinc等,1993; Bevec等,1996 )。在Cat L缺陷小鼠研究中觀察 到其不能降解胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞中恒定鏈(Nakagawa等,1998),并且表 現(xiàn)出在CD4屮T細(xì)胞選擇中的明顯缺陷(Roth等,2000)。缺失組織蛋白 酶L小鼠由于毛囊形態(tài)形成中的改變也形成周期性落發(fā)和表皮增殖性異常 (epidermal hyperplasia)。
由于它的普遍存在的表達(dá)(ubiquitous expression)和它的降解細(xì)胞外 基質(zhì)和基底膜組分的能力,Cat L在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中作用也被非常詳細(xì) 研究。Cat L升高的表達(dá)水平與寬范圍的惡性腫瘤有關(guān),包含乳腺癌、結(jié) 腸癌、前列腺癌、腎癌和星形細(xì)胞癌等。
最近的證據(jù)也提示了 Cat L可能作為轉(zhuǎn)錄激活因子起作用。先前報(bào)道 了 Cat L的備選同工型(Rescheleit等,1996; Seth等,2003 ),然而缺失N 末端信號(hào)肽的同工型顯示其集中在細(xì)胞核,提示了在加工CDP/Cux轉(zhuǎn)錄因 子中Cat L的作用。這個(gè)理論被Cat L缺陷型成纖維細(xì)胞研究加強(qiáng),所述 研究中出現(xiàn)CDP/Cux加工的顯著減少(Goulet等,2004 )。由幾個(gè)獨(dú)立組在下一年描述人同源物(ortholog)前(Bromme等,1995; Shi等,1995; Inaoka等,1995 ),組織蛋白酶K于1994年最初從cDNA兔 中克隆(Tezuka等,1994)。編碼CatK的基因位于人染色體lq21上,與 CatS相同的部位,提示了所述的兩種蛋白酶可能擁有共同起源。CatK啟 動(dòng)子結(jié)構(gòu)與Cat S結(jié)構(gòu)相似,缺失TATA框但出現(xiàn)2個(gè)AP-1位點(diǎn);兩種基 因的公共特性都顯示限制表達(dá)才莫式(restricted expression pattern)。人Cat K 表達(dá)已顯示為限制性并且主要在破骨細(xì)胞和卵巢中發(fā)現(xiàn)(Bromme等,1995; Drake等,1996 )。
Cat K氨基酸序列顯示了與組織蛋白酶S和L的高度序列相似性(分 別是52%和46% ),并且在哺乳動(dòng)物溶酶體半胱氨酸蛋白酶中這三種基 因一起形成小型亞家族。CatK已表現(xiàn)出最有效的彈性蛋白酶(elastinolytic enzymes)之一的特征,具有胰彈性蛋白酶在pH 5.5條件下更多的活性 (Bromme等,1996; Chapman等,1997 )。它也具有催化膠原I、 II和IV型 水解的能力(Kafienah等,1998)。
通過(guò)與骨病癥(bone disorder)和致密性成骨不全癥的關(guān)聯(lián)舉例說(shuō)明 CatK溶膠原活性的生理相關(guān)性(Gelb等,1996)。致密性成骨不全癥是一種 常染色體隱性遺傳病癥,特征在于骨樣硬化和嚴(yán)重骨骼發(fā)育不良。當(dāng)打破 骨吸收和形成之間的平衡時(shí)(傾向于吸收)發(fā)生骨質(zhì)疏;卩>。吸收是通過(guò)破 骨細(xì)胞介導(dǎo),其在它們結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生酸性環(huán)境,所述位點(diǎn)發(fā)生基質(zhì)的蛋白 降解。由于在致密性成骨不全癥患者中鑒定無(wú)義、錯(cuò)義和終止密碼子突變, Cat K牽涉于這個(gè)過(guò)程中(Gelb等,1996 ) 。 Cat K敲除鼠在它們的石皮骨細(xì) 胞中也顯示了下降的基質(zhì)降解活性,然而,鼠類(lèi)表型的嚴(yán)重性低于人類(lèi)病 癥(Saftig等,1998 )。
通過(guò)破骨細(xì)胞系中^L黃酸作用,在炎癥位點(diǎn)Cat K表達(dá)出現(xiàn)正調(diào)節(jié) (Saneshige等,1995 )。它的表達(dá)在骨的巨細(xì)胞腫瘤(giant cell tumour)、 前列腺和乳腺癌(Bmbaker等,2003; Littlewood-Evans等,1997 ),以及在 有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液成纖維細(xì)胞(synovial fibroblasts )中被檢測(cè) 到(H腿mel等,1998)。組織蛋白酶V最初從人腦CDNA文庫(kù)中作為半胱氨酸蛋白酶鑒定,
與CatL有格外的高度同源性(78%) (Santamaria等,1998)。而且,編 碼CatV的基因繪圖在人染色體9q21-22中,鄰近CatL。在CatL和V基 因間的高度同源性和十分靠近提示了兩種蛋白酶可能從共同的祖先前體 (ancestral precursor)進(jìn)化而來(lái)(Itoh等,1999; Bromme等,1999 )。然而, 以Cat L觀察到的普遍表達(dá)模式?jīng)]有被Cat V模仿,Cat V表達(dá)限制在胸腺、 睪丸和角膜上皮中(Adachi等,1998, Bromme等,1999, Tolosa等,2003 )。 這種蛋白酶的限制組織表達(dá)(restricted tissue expression)指示了特殊功能 并且認(rèn)為Cat V在特殊細(xì)胞類(lèi)型MHC II類(lèi)抗原遞呈中是重要的(Shi等, 1999; Tolosa等,2003 )。與其他人類(lèi)組織蛋白酶序列對(duì)比,CatV位于如 CatL、 S和K的人C1肽酶的相同種系發(fā)育分支中(Buhling等,2000)。
組織蛋白酶的病理關(guān)聯(lián)
蛋白酶表達(dá)^f莫式的改變成為許多人類(lèi)病理過(guò)程的基礎(chǔ)。組織蛋白酶失 控的表達(dá)(deregulated expression)和活性,與一系列病癥連鎖,所述病癥 包括神經(jīng)退化疾病、自身免疫性疾病和肝瘤發(fā)生(tumourigenesis )。
Cat S上調(diào)與幾種神經(jīng)退化疾病有關(guān)。它被認(rèn)為在淀粉樣前體蛋白(APP) 里產(chǎn)生卩肽(Aj3)中有作用(Munger等,1995)并且顯示它的表達(dá)被阿爾茨 海默氏病和唐氏綜合征上調(diào)(Lemere等,1995 )。通過(guò)Cat S降解髓磷脂 堿蛋白(一種潛在自身抗原,牽涉于MS發(fā)病機(jī)理(Beck等,2001)和CJD 患者中)的能力,Cat S在多發(fā)性硬化癥和Creutzfeldt - Jakob病中也發(fā)揮 作用,已顯示Cat S表達(dá)增加超過(guò)4倍(Baker等,2002 )。
異常Cat S表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。在正常動(dòng)脈中Cat S表達(dá)可忽略 不計(jì),然而人動(dòng)脈粥樣化顯示了強(qiáng)免疫反應(yīng)性(Sukhova等,1998)。使用 Cat S和低密度脂蛋白受體二者缺陷的敲除鼠深入研究顯示,形成明顯較少 的動(dòng)脈粥樣硬化(Sukhova等,2003 )。深入研究把Cat S表達(dá)與炎性肌病 (inflammatory muscle disease)和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎耳關(guān)系起來(lái)。來(lái)源于炎性 肌病患者肌肉活組織檢查標(biāo)本的Cat S表達(dá)與對(duì)照肌肉切片相比有10倍增 加(Wiendl等,2003 ),來(lái)源于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中Cat S表達(dá)水 平與骨關(guān)節(jié)炎相比明顯較高(Hashimoto等,2001 )。研究了在特殊的惡性腫瘤中Cat S的作用。已顯示在肺部腫瘤和前列 腺癌切片中Cat S表達(dá)與正常組織相比明顯較多(Kos等,2001, Fernandez 等,2001 ),并且提示了 CatS可能在腫瘤侵襲和疾病發(fā)展中發(fā)揮作用。
本實(shí)驗(yàn)室最近對(duì)Cat S的工作證明了在人類(lèi)星形細(xì)胞瘤中它的表達(dá)重 要性(Fla皿ery等,2003; Flannery等,2006 )。免疫組織化學(xué)分析顯示了來(lái) 源于WHO I到IV級(jí)的一組星形細(xì)胞瘤活;險(xiǎn)標(biāo)本中Cat S的表達(dá),但是出 現(xiàn)了正常星形細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的缺席。在IV級(jí) 腫瘤中Cat S表達(dá)出現(xiàn)最大值,并且在由IV級(jí)腫瘤衍生的培養(yǎng)物中胞外活 性水平最高。
已顯示Cat S在降解例如層粘連蛋白、月交原、彈性蛋白和^琉酸軟骨素 蛋白聚糖等ECM大分子(Liuzzo等,1999 ),以及使用U251MG IV級(jí)惡 性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的侵襲實(shí)驗(yàn)中是有活性的,所述實(shí)驗(yàn)顯示在Cat S抑制劑 LHVS29存在時(shí)侵襲下降達(dá)61% (Flannery等,2003)。這提示了 Cat S可能 在星形細(xì)胞瘤腫瘤侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并且因此可成為抗侵襲治療 靶點(diǎn)。
也發(fā)現(xiàn)Cat L在包括腫瘤發(fā)生的不同病理學(xué)病癥范圍內(nèi)發(fā)揮重要作 用。Cat L敲除鼠的產(chǎn)生顯示了在表皮穩(wěn)態(tài)(epidermal homeostasis )中的 關(guān)鍵性作用,調(diào)節(jié)毛發(fā)周期和在胸腺的皮質(zhì)上皮細(xì)胞中MHC n類(lèi)介導(dǎo)的 抗原遞呈(Reinheckel等,2001 )。
Cat K表達(dá)先前已與包括骨質(zhì)疏松和特殊的惡性腫瘤的不同病理學(xué)范 圍相關(guān)。致密性成骨不全癥這種罕見(jiàn)的骨骼病癥,由CatK缺陷引起。Cat K通常功能是降解1型膠原和其他骨蛋白(Motyckova和Fisher, 2002 )。 來(lái)源于患有致密性成骨不全癥患者的破骨細(xì)胞由于組織蛋白酶K基因內(nèi)突 變而具有功能失調(diào)性(Gelb等,1996)。
Cat K表達(dá)與肺腺癌但不與非侵入性細(xì)支氣管肺泡癌有關(guān),充當(dāng)肺癌 侵襲性生長(zhǎng)的潛在標(biāo)記(Rapa等,2006 )。此外,CatK也作為骨巨細(xì)胞腫 瘤中的主要蛋白酶被鑒定(Lindeman等,2004),并且顯示與乳腺癌關(guān)聯(lián) (Littlewood-Evans等,1997 )。因此,Cat K抑制劑的開(kāi)發(fā)有巨大潛力尤其在病理學(xué)病癥中,所述病癥發(fā)生了過(guò)量破骨細(xì)胞活化和骨吸收,例如骨 質(zhì)疏松、骨轉(zhuǎn)移和多發(fā)性骨髓瘤。
CatV作為與CatL有格外高度同源(78% )的半胱氨酸蛋白酶,最初 從結(jié)腸直腸和乳腺癌以及某些卵巢和腎細(xì)胞癌中鑒定(Santamaria等, 1998)。而且,Cat V基因被繪圖在人染色體9q21-22中,鄰近CatL。高 度同源性和它們的編碼基因的十分靠近提示了兩種蛋白酶可能從共同的 祖先前體進(jìn)化而來(lái)(Itoh等,1999; Bromme等,1999 )。然而,盡管Cat L 有廣泛的組織表達(dá),CatV通常局限于胸腺、睪丸和角膜上皮(Adachi等, 1998; Bromme等,1999 )。這種蛋白限制的組織表達(dá)指示了特殊的功能, 并且認(rèn)為Cat V在特殊細(xì)胞類(lèi)型的MHC II類(lèi)抗原遞呈中是重要的(Shi等, 1999; Tolosa等,2003 )。
在一系列疾病范圍內(nèi),觀察到組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶表達(dá)和活性的 增加并且牽涉它們的發(fā)病機(jī)理。因此,特異性導(dǎo)向(targeting)這些蛋白 酶的抑制劑的產(chǎn)生有作為治療劑的潛力。
組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶的抑制
當(dāng)?shù)鞍酌高^(guò)度表達(dá)時(shí),治療策略就集中在開(kāi)發(fā)用于阻斷這些酶活性的 抑制劑。針對(duì)組織蛋白酶的特異性小分子抑制劑,由于選擇性和特異性問(wèn) 題其產(chǎn)生在過(guò)去證明是困難的。二肽ot - S同-p -醛作為針對(duì)Cat S的有效 可逆抑制劑由Walker等開(kāi)發(fā),具有抑制Cat B和L的能力(雖然以較低效 力)(Walker等,2000 ),并且Cat S抑制劑4 -嗎啉尿素-亮氨酸-高苯 丙氨酉爽—乙丈希石風(fēng)(4-Morpholineurea-Leu-HomoPhe-vinylsulphone ) (LHVS) 當(dāng)以高濃度使用時(shí)也顯示能抑制其他的組織蛋白酶(Palmer等,1995 )。
Cat L類(lèi)蛋白酶小分子抑制劑的開(kāi)發(fā),可逆和不可逆二種都有較多文 獻(xiàn)記載。這種化合物的臨床應(yīng)用由于低特異性、抑制正常組織中蛋白酶和 對(duì)于旁觀者蛋白(bystander protein)可能的反應(yīng)性而不可靠(Turk等, 2004)。因此能夠僅導(dǎo)向分泌蛋白水解活性的另一種策略具有吸引力。此 外,由于從基因敲除研究(Saftig等,l"8; Nakagawa等,1998; Nakagawa 等,1999)中顯示的功能重疊,可證明對(duì)于蛋白酶的所述亞家族具有高度在所有表征的前肽中,CatSPP具有最感興趣的抑制動(dòng)力圖(inhibitory kinetic profile ),因?yàn)樗浅?Cat S之外,Cat L和Cat K 二者的均等有 效抑制劑。Maubach和同事們?cè)诰範(fàn)幮悦附Y(jié)合測(cè)定中顯示CatSPP是Cat S (Ki是0.27 nM )和Cat L(Ki是0.36 nM)的等效抑制劑(Maubach等,1997), 然而更近的工作提示,與它對(duì)Cat S的作用(IQ是7.6 nM)和與幾乎同等效 率對(duì)于Cat K的作用(IQ是7.0 nM)相比,CatSPP實(shí)際上是對(duì)于Cat L (IQ 是0.46nM)的更有效的抑制劑(Guay等,2000)。
如上描述,通常對(duì)于組織蛋白酶的活化,天然前肽要經(jīng)過(guò)構(gòu)象變化和 釋放。釋放之后,前肽假定為多余的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人令人驚奇的顯示了外源應(yīng)用的組織蛋白酶S前肽(CatSPP ) 具有在侵入性癌模型中有效特異性抑制組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶活性的功 能。這個(gè)結(jié)果是非常始料未及地,因?yàn)楝F(xiàn)在認(rèn)為一旦半胱氨酸組織蛋白酶 在體內(nèi)激活,遺留的前肽片段便是多余的并且不再對(duì)于蛋白酶有任何作 用。假定在相同的體內(nèi)條件下,外源加入的前肽與其相似地沒(méi)有作用。而 且,考慮到前肽是本質(zhì)上堿性的,存在于細(xì)胞中和表面的胰蛋白酶類(lèi)活性 預(yù)期能損壞任何外源前肽。
這些結(jié)果指示,與期待結(jié)果相反,組織蛋白酶前肽可用于弱化侵襲性 或轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的發(fā)展,并且因此可用于治療領(lǐng)域。
相應(yīng)地,在本發(fā)明的第一方面,提供了一種在細(xì)胞或組織中抑制組織 蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶活性的方法,所述方法包括施用組織蛋白酶前肽或編 碼組織蛋白酶前肽的核酸到所述的細(xì)胞或組織中。
在一個(gè)實(shí)施方式中,方法是體外方法。在另一個(gè)實(shí)施方式中方法是體 內(nèi)方法。
活性可被完全或部分抑制。因此所述方法可用于降低異?;钚灾琳?活性。
在本發(fā)明的笫二方面,提供了一種在細(xì)胞或組織中抑制組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶過(guò)度表達(dá)的方法,所述方法包括施用組織蛋白酶前肽或編碼組 織蛋白酶前肽的核酸到所述的細(xì)胞或組織中。
在另 一方面,提供了 一種在需要對(duì)其治療的患者中治療與組織蛋白酶 L _類(lèi)蛋白酶異常活性和/或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥的方法,所述方法包括施 用組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸。
更進(jìn)一 步提供了 一種用于藥物中的組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白 酶前肽的核酸。
本發(fā)明還提供了一種用于治療病癥的組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋
白酶前肽的核酸,所述病癥與組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶異?;钚院?或過(guò)度 表達(dá)有關(guān)。
還提供了組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸在制備藥物 中的應(yīng)用,所述藥物用于治療與組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶異?;钚院?或過(guò) 度表達(dá)有關(guān)的病癥。
在另一方面,本發(fā)明提供了一種藥物組合物,其包括組織蛋白酶前肽 或編碼組織蛋白酶前肽的核酸。
組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶由組織蛋白酶L蛋白酶、組織蛋白酶S蛋白 酶、組織蛋白酶K蛋白酶和組織蛋白酶V蛋白酶組成。
用于本發(fā)明的組織蛋白酶前肽可以是任何物種的組織蛋白酶前肽。在 一個(gè)實(shí)施方式中,所述物種是哺乳動(dòng)物,例如小鼠、大鼠和人等。在一個(gè) 實(shí)施方式中,所述組織蛋白酶前肽是人組織蛋白酶前肽,例如具有與登記 號(hào)M90696中公開(kāi)的組織蛋白酶S蛋白酶氨基酸殘基17至113相應(yīng)的氨基 酸序列(復(fù)制為圖3中顯示氨基酸序列的13至109氨基酸殘基)的人組 織蛋白酶前肽。
在本發(fā)明范圍中,組織蛋白酶前肽包含組織蛋白酶前肽,所述組織蛋 白酶前肽包括野生型哺乳動(dòng)物組織蛋白酶前肽或其片段或衍生物的氨基 酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中,組織蛋白酶前肽由具有野生型哺乳動(dòng)物組織 蛋白酶前肽氨基酸序列的肽組成。
在一個(gè)實(shí)施方式中,用于本發(fā)明中的組織蛋白酶前肽或其衍生物或片段是組織蛋白酶S前肽,例如,由登記號(hào)M90696中公開(kāi)的組織蛋白酶S 蛋白酶中17至113氨基酸組成(復(fù)制為圖3b中顯示氨基酸序列的13至 109氨基酸殘基)。
組織蛋白酶前肽可合并有標(biāo)記,例如多組氨酸標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式 中,組織蛋白酶前肽是具有多組氨酸標(biāo)記的組織蛋白酶前肽,所述標(biāo)記與 圖3b中顯示的氨基酸序列1至118 —樣。
如實(shí)施例中所描述,使用組織蛋白酶前肽融合到抗體Fc部分的腫瘤 侵襲測(cè)定中證明了腫瘤侵襲的具體有效抑制。通過(guò)提供作為融合肽的組織 蛋白酶前肽與抗體Fc部分,分子形狀就會(huì)預(yù)期改變,尤其令人驚奇的是, 不僅組織蛋白酶前肽保持了它抑制侵襲的能力,而且它的抑制活性與沒(méi)有 Fc部分的組織蛋白酶前肽相比明顯更高。
相應(yīng)地,在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中,組織蛋白酶前肽包括抗體Fc部 分。在這個(gè)實(shí)施方式中,F(xiàn)c部分是b型IgG Fc部分,例如鼠b型IgG Fc部分。
用于本發(fā)明中的組織蛋白酶前肽可用于治療任何與組織蛋白酶L-類(lèi) 蛋白酶異常表達(dá)有關(guān)的病癥。例如,可使用本發(fā)明的病癥包括但不限于腫 瘤性疾病、炎性疾病、神經(jīng)退化疾病(neurodegenerative disorder )、自身免 疫性疾病、哮喘或動(dòng)脈粥樣硬化。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中,所述病癥是 與組織蛋白酶S過(guò)度表達(dá)和/或異常活性有關(guān)的病癥。
本發(fā)明每個(gè)方面的優(yōu)選特征是對(duì)于每個(gè)其他方面做必要變更,除非本 文另有要求。
具體實(shí)施例方式
如上文所描述和實(shí)施例中證明地,本發(fā)明人顯示與所期待的相反,組 織蛋白酶前肽在腫瘤侵襲測(cè)定中作用是有效抑制組織蛋白酶L-類(lèi)型蛋白 酶活性,尤其是CatS、 CatL、 CatV和CatK活性,并且顯示使用改良的博 伊登室侵襲測(cè)定(Boyden chamber invasion assay)方法,組織蛋白酶前肽 有效阻斷了在乳腺、結(jié)腸、前列腺和星形細(xì)胞瘤模型中的肺瘤侵襲。這些結(jié)果證明了這種分子能夠作用于肺瘤發(fā)生,弱化侵襲性或轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的 發(fā)展的效力。
組織蛋白酶前肽
用于本發(fā)明中的組織蛋白酶前肽可以是任何物種的組織蛋白酶前肽, 例如哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中,組織蛋白酶前肽是人組織蛋白酶前肽,
例如包括與M90696中的氨基酸殘基17至113具有相應(yīng)序列的氨基酸(復(fù) 制為圖3中顯示氨基酸序列的13至109氨基酸殘基)的組織蛋白酶前肽。
在本發(fā)明范圍中,組織蛋白酶前肽包括含野生型哺乳動(dòng)物組織蛋白酶 前肽或其片段或衍生物的氨基酸序列的組織蛋白酶前肽。在一個(gè)實(shí)施方式 中,組織蛋白酶前肽由具有野生型哺乳動(dòng)物組織蛋白酶前肽氨基S吏序列的 肽組成。
在一個(gè)實(shí)施方式中,用于本發(fā)明的組織蛋白酶前肽或其衍生物或片段 是組織蛋白酶L-類(lèi)型蛋白酶前肽。例如,用于本發(fā)明的組織蛋白酶前肽 或其衍生物或片段可以是組織蛋白酶S前肽。
用于本發(fā)明的組織蛋白酶前肽片段通常指一段氨基酸殘基,含有至少 IO個(gè)連續(xù)的氨基酸,通常至少20,例如至少至少30,例如至少50或野生 型組織蛋白酶前肽中更多連續(xù)的氨基酸。
用于本發(fā)明中的組織蛋白酶前肽"衍生物"通常指一種多肽,所述多肽 與野生型組織蛋白酶前肽相比,其通過(guò)改變氨基酸序列一皮修飾,例如通過(guò) 控制編碼蛋白的核酸或通過(guò)改變蛋白本身。這種衍生物可以包括插入、添 加、缺失和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中,衍生物可包括 插入、添加、缺失和/或耳又代25個(gè)或更少的氨基酸,例如15個(gè)或更少,通 常10個(gè)或更少,例如5個(gè)或更少例如^叉1個(gè)或2個(gè)氨基酸。組織蛋白酶 前肽的肽衍生物可含有其他氨基酸,但不是天然氨基酸或取代的氨基酸。 例如,能從模擬肽(Peptidomimetic )中獲得衍生物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,組織蛋白酶前肽包括Fc部分。
可用于本發(fā)明中組織蛋白酶前肽的片段或衍生物優(yōu)選保持組織蛋白 酶前肽功能活性,所述活性是抑制腫瘤侵襲的能力,例如在肺瘤才莫型中,例如使用改良的博伊登室侵襲測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中,組織蛋白酶前肽
片,爻或纟汙生物保持至少50 % ,例如至少75 % ,至少85 %或至少90 %的野
生型人組織蛋白酶前肽肺瘤侵襲抑制活性。
用于本發(fā)明中的組織蛋白酶前肽、片段和衍生物可使用本領(lǐng)域已知的 任4可方法生產(chǎn)。
然而本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了用于組織蛋白酶前肽簡(jiǎn)化重組生產(chǎn)的新穎簡(jiǎn)化 方法。如實(shí)施例中顯示地,本發(fā)明人證明重組組織蛋白酶前肽可成功地表
達(dá)為帶有N末端6組氨酸標(biāo)記,并且使用再折疊金屬離子親和層析(IMAC ) 純化。
相應(yīng)地,在本發(fā)明的一個(gè)方面,組織蛋白酶前肽由一種方法生產(chǎn),所 述方法包括純化步驟,所述步驟包括金屬離子親和層析(IMAC)。
實(shí)際上,在本發(fā)明另一個(gè)獨(dú)立方面中,提供了一種重組產(chǎn)生組織蛋白 酶前肽的方法,所述方法包括表達(dá)具有N末端多組氨酸標(biāo)記的組織蛋白酶 前肽以及使用金屬離子親和層析(IMAC)純化表達(dá)的前肽。在一個(gè)實(shí)施 方式中,在含有尿素的緩沖液存在下純化所述前肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解IMAC原理。據(jù)信吸附是基于金屬配位絡(luò)合 物的形成,所述絡(luò)合物形成于通過(guò)螯合作用固定在吸附基質(zhì)表面的金屬離 子,和待結(jié)合的蛋白表面的易接近的電子供體氨基酸之間。
相似地,添加多組氨酸標(biāo)記到重組蛋白中在本領(lǐng)域內(nèi)廣泛知曉(例如 參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,569,794)。
核酸
本發(fā)明的和用于本發(fā)明中的核酸可包括DNA或RNA??梢灾亟M、合 成或通過(guò)本領(lǐng)域可用的任何方法生產(chǎn)核酸,包含使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的克隆。
核酸可插入到任何適當(dāng)?shù)妮d體中。在一個(gè)實(shí)施方式中載體是表達(dá)載體 并且核酸可操作地與控制序列連接,所述控制序列能夠在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn) 所述核酸的表達(dá)。可以使用多種載體。例如合適的載體可包括病毒(例如 痘苗病毒、腺病毒和桿狀病毒等)、酵母載體、噬菌體、染色體、人工染 色體、質(zhì)?;蛘沉NA??墒褂幂d體把核酸引入宿主細(xì)胞中。很多種宿主細(xì)胞可用來(lái)表達(dá)用于 本發(fā)明中的核酸。用于本發(fā)明的合適的宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。 它們包括細(xì)菌(例如大腸桿菌)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。可使 用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包含中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO鼠黑色 素瘤細(xì)胞、猴和人細(xì)胞系和其衍生物和許多其他種類(lèi)。
可使用,調(diào)節(jié)表達(dá)、修飾、和/或特異性加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞林。
所述加工可包括糖基化、泛素化(ubiquination)、 二石克4建形成和廣泛的翻譯 后修飾。
用于操縱核酸,例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、序列測(cè)定、引入DNA 到細(xì)胞中和基因表達(dá)和分析蛋白質(zhì)的已知技術(shù)和方案的更多詳細(xì)內(nèi)容參 閱,例如,Current Protocols in Molecular Biology,第2版,Ausubel等編輯, John Wiley和Sons, 1992和,Molecular Cloning: a Laboratory Manual :第3 版Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000。
治療
"治療"包含對(duì)人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物有益的任何方案(regime )。治療可以 是關(guān)于現(xiàn)存的病癥或可以是預(yù)防性的(預(yù)防治療)。治療可以包含治愈、 緩解或預(yù)防效果。
本發(fā)明的和用于本發(fā)明的組織蛋白酶前肽、核酸和方法可用于治療許 多醫(yī)療病癥。這些病癥包括炎性疾病、神經(jīng)退化疾病、自身免疫性疾病、 癌癥、哮喘和動(dòng)脈粥樣硬化。具體而言,它們可用于治療與組織蛋白酶過(guò) 度表達(dá)(即多于相似可比的正常健康細(xì)胞)和/或異?;钚?例如多于相似 可比的正常健康細(xì)胞)有關(guān)的病癥。
本發(fā)明的和用于本發(fā)明的前肽、核酸和方法可用于治療癌癥。"治療癌 癥"包含治療由癌生長(zhǎng)引起的病癥,并且包含治療肺瘤增殖或腫瘤。本發(fā)明 可特別應(yīng)用于治療存在的癌癥和預(yù)防初次治療或手術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)。
使用本發(fā)明能夠治療的腫瘤的例子包含,例如肉瘤(包含成骨和軟組 織肉瘤)、癌(例如乳腺、肺、膀胱、甲狀腺、前列腺、結(jié)腸、直腸、胰 腺、胃、肝、子宮、前列腺、子宮頸和卵巢癌)、淋巴瘤(包含霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、維爾姆斯瘤和白血 病(包含急性成淋巴細(xì)胞性白血病和急性成髓細(xì)胞性白血病)、星形細(xì)胞 瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和一見(jiàn)網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。
在一個(gè)實(shí)施方式中,癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和星形細(xì)胞瘤。
Grave's病、炎性肌病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
使用本發(fā)明的結(jié)合成分(bindingmember)、核酸和方法可治療的神經(jīng) 退化疾病包括但不限于,阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化癥和 Creutzfeldt — Jakob病。
顯示動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖癥與異常CatS相關(guān)。在感染中顯示組織蛋白酶L 加工TB抗原,因而可能阻止了它們的正常加工。
藥物組合物
本發(fā)明的和用于本發(fā)明的前肽和核酸可作為藥物組合物施用。根據(jù)本 發(fā)明并且依照本發(fā)明使用的藥物組合物可包括,除了活性成份以外,藥學(xué) 可接受的賦形劑、載體、緩沖液穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉的其他 物質(zhì)(參閱例如,Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版, Gennaro AR,等編輯,.Lippincott Williams & Wilkins, 2005 )。所述物質(zhì)可 包括緩沖劑例如醋酸鹽、Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸;抗氧化 劑;防腐劑;蛋白質(zhì)例如,血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白類(lèi);親水聚合 物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸例如,甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨 酸、精氨酸或賴(lài)氨酸;碳水化合物;螯合劑;張力調(diào)節(jié)劑(tonicifier)或 表面活性劑。
組合物也可含有一種或多種為治療特殊適應(yīng)癥所需選擇的其他活性 4b合物,優(yōu)選具有互4卜活性(complementary activity),所述活性不會(huì)反向 影響本發(fā)明前肽、核酸或組合物的活性。例如,在治療癌癥中,除了組織 蛋白酶前肽之外,制劑可包括結(jié)合一種或多種組織蛋白酶L-類(lèi)型蛋白酶的抗體,或結(jié)合一些其他靶點(diǎn)例如生長(zhǎng)因子(例如影響特定癌癥的生長(zhǎng)) 的抗體,和/或化學(xué)治療劑。
活性成分(例如前肽和/或化學(xué)治療劑)可經(jīng)由微球、微嚢脂質(zhì)體和其 他微粒遞藥系統(tǒng)給藥。例如,在膠體遞藥系統(tǒng)中(例如,脂質(zhì)體、白蛋白 微球、微乳液、毫微型顆粒和毫微型膠嚢)或在粗乳狀液中,例如通過(guò)凝 聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微嚢
(gelatinmicrocapsule )和聚-(甲基丙烯酸酯)微嚢),有效成分可被包 埋入所制備的微嚢。關(guān)于更多詳細(xì)內(nèi)容,參閱Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Gennaro AR,等編輯,.Lippincott Williams & Wilkins, 2005。
緩釋制劑(sustained-release preparation)可用來(lái)遞送活性劑。適合的 緩釋制劑例子包含固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)(含有抗體),所述基質(zhì) 具有成形物品形式(shaped article),例如膜、栓劑或微嚢。緩釋基質(zhì)的 例子包含聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、 多乳酸化合物(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3, 773, 919)、 L-谷氨酸和乙基-L谷氨酸共聚物、 非降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解乳酸-羥乙酸共聚物和聚-D- (-)-3-羥基丁 酸。
對(duì)于醫(yī)學(xué)療法,本文描述的前肽,至少在一些實(shí)施方式里,預(yù)期施用 到人類(lèi)或其他哺乳動(dòng)物中。
肽通常是腸胃外施用,并且容易被血漿蛋白酶代謝。口服施用,可能 是最有吸引力的施用方式,但也可能更有問(wèn)題。在胃中,酸降解和酶破壞 肽。幸存進(jìn)入腸中完整的肽遭受另外的蛋白水解,因?yàn)樗鼈冞B續(xù)地被許多 種酶攻擊,所述酶包含胃和胰酶、外和內(nèi)肽酶和刷狀緣(bmshborder)肽酶。
結(jié)果,嚴(yán)重限制了從腸腔通過(guò)到達(dá)血流的肽。然而,開(kāi)發(fā)了多種前藥能夠 腸胃外和口服施用治療肽。
肽能結(jié)合多種部分,例如聚合部分,以修飾肽藥的生理化學(xué)性質(zhì),例 如,增加對(duì)酸和酶降解的抵抗力并且增強(qiáng)這種藥橫穿粘膜的滲透。例如, Abuchowski和Davis對(duì)于書(shū)t生酶描述了多種方法以提供水溶性的、非免疫 原'l"生的、體內(nèi)穩(wěn)、定的產(chǎn)物("Soluble polymers-Enzyme adducts," Enzymes asDrugs,編輯Holcenberg禾口 Roberts, J. Wiley and Sons, New York, N. Y. (1981) ) 。 Abuchowski和Davis討論了結(jié)合酶與聚合物質(zhì)(例如葡聚糖、 聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸)的多種方式。對(duì)于腸胃外 應(yīng)用,產(chǎn)生的結(jié)合多肽保持了它們的生物活性和水溶性。US 4,179,337教 授了偶合肽到聚乙二醇或聚丙二醇(polypropropylene glycol)(具有500至 20,000道爾頓分子量),以此提供了具有生理活性非免疫原性水溶性多肽組 合物。聚乙二醇或聚丙二醇保護(hù)多肽防止活性損失,而且組合物可以注射 到哺乳動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)而基本上沒(méi)有免疫原性應(yīng)答。
US 5,681,811、 US 5,438,040和US 5,359,030公開(kāi)了穩(wěn)定的、結(jié)合多肽 絡(luò)合物,所述絡(luò)合物包含偶聯(lián)到低聚物中的治療劑,所述低聚物包含親脂 和親水部分。Garmen等描述了蛋白-PEG前藥(Garman, A丄,和Kalindjian, S. B., i^5SLe"., 1987, "3, 361-365 )。前藥能使用這種化學(xué)作用制備通 過(guò)首先從多元分散系MPEG5000中制備馬來(lái)酸酐試劑,然后結(jié)合這個(gè)試劑 到本文公開(kāi)的肽上。氨基酸與馬來(lái)酸酐的反應(yīng)是已知的。馬來(lái)?;?酰胺 鍵水解重新形成含胺藥,其是由鄰近存在的游離羧基協(xié)助,并且通過(guò)雙鍵 構(gòu)成起化學(xué)反應(yīng)的幾何結(jié)構(gòu)。在生理?xiàng)l件下能釋放(通過(guò)水解前藥)肽。
所述策略可用于遞送前肽而用于本發(fā)明中。
經(jīng)由可降解鍵,肽也能被聚合物例如多元分散系PEG偶聯(lián),例如可降 解鍵顯示(關(guān)于聚乙二醇化的干擾素a-2b)在Roberts, M丄,等,爿A /> g De/,ve/7 i ev. , 2002, 54, 459-476中。
肽也能連接到聚合物例如PEG,使用1,6或1,4卡基排除(BE)策略 (參閱例如,Lee, S.,等,Bioconjugate Chem. , (2001), 12, 163-169; Gree畫(huà)ld, R. B.,等,US 6,180,095, 2001; Gre匿ald, R. B.,等,J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667.);三甲基鎖內(nèi)酯化(TML)的使用(Greenwald, R. B.,等,J. Med. Chem., 2000, 43, 475-487 ); PEG羧酸與羥基末端羧酸連接 體的偶Jf關(guān)(Roberts, M. J., J. Pharm. Sci., 1998, 87(11), 1440-1445 )和PEG 前藥,其包括MPEG苯醚和MPEG苯曱酰胺家族,經(jīng)由芳基氨基甲酸酯 連接到含胺藥上(Roberts, M.J.,等,Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476 ),包含前藥結(jié)構(gòu),所述結(jié)構(gòu)包括在氨基曱酸酯和PEG酰胺或醚之間的間位關(guān)系(metarelationship) (US 6,413,507);和包括還原機(jī)制(與水解 機(jī)制相反)的前藥(Zalipsky, S.,等,Bioconjugate Chem., 1999, 10(5), 703-707 )。
一些在胃腸道中包括使用酶抑制劑來(lái)降低蛋白和肽降解速度的方法 可用于本文描述的前肽;調(diào)整pH使局部消化酶失活;使用滲透促進(jìn)劑通 過(guò)增加它們的旁細(xì)胞和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)改善肽的吸收;使用毫微型顆粒作微粒 載體使其容易被腸上皮完整吸收,尤其是派伊爾淋巴集結(jié),以及增加對(duì)酶 降解抵抗力;在腸腔中液體乳劑保護(hù)藥物免受化學(xué)作用和酶的破壞;以及 用于水溶性差的藥品的微團(tuán)制劑。
在一些例子中,能以具有腸溶衣的適合膠嚢或片劑提供肽,使得肽不 會(huì)在胃中釋放??蛇x擇地或另外地,肽能作為前藥提供。在一個(gè)實(shí)施方式 中,肽存在于這些給藥裝置中作為前藥。
能用肽的游離氨基、羥基或羧基使肽變換成前藥。前藥包括化合物, 其中一個(gè)氨基酸殘基或含有二個(gè)或多個(gè)(例如二、三或四)氨基酸殘基的 多肽鏈,其通過(guò)肽鍵共價(jià)結(jié)合多種聚合物的游離氨基、羥基或羧酸基團(tuán), 所述聚合物例如,聚亞烷基二醇類(lèi)(例如聚乙二醇)。前藥也包含化合物, 其中碳酸酯、氨基曱酸酯、酰胺和烷基酯通過(guò)C末端羧酸共價(jià)結(jié)合到上述 肽。
包括本發(fā)明的肽(前肽)的前藥,或本發(fā)明的肽(包括類(lèi)似物和片段) 從其中被釋放或具有釋放性的前藥,被認(rèn)為是本發(fā)明的衍生物。
模擬肽
本發(fā)明進(jìn)一步包括了模擬前肽的應(yīng)用,其可用作治療肽。模擬前肽是 短肽,其^t擬本文描述的組織蛋白酶前肽的生物活性。這種^t擬肽可從本 領(lǐng)域已知的方法獲得,例如不限于,噬菌體展示或組合化學(xué)。例如,由 Wrighton,等,Scwwce 273:458-463 (1996)公開(kāi)的方法能用于產(chǎn)生模擬QUB 698.8肽。
如上描述的編碼組織蛋白酶前肽的核酸也可用在治療方法中。所述核 酸使用本領(lǐng)域任何適合的技術(shù)可遞送到目的細(xì)胞中。使用體內(nèi)或間接體內(nèi)技術(shù)核酸(任選地包含在載體中)可遞送到患者細(xì)胞中。關(guān)于體內(nèi)技術(shù), 病毒載體(例如腺病毒、單純皰滲I型病毒或腺相關(guān)病毒)轉(zhuǎn)染和基于脂
質(zhì)的體系(例如,用于脂質(zhì)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的有用脂質(zhì)是DOTMA、 DOPE 和DC-膽固醇)可被使用(參閱例如,Anderson等,Science 256 : 808-813 (1992).也可參閱WO 93/25673 )。
在間接體內(nèi)技術(shù)中,用修飾細(xì)胞施用到患者方式把核酸引入到患者分 離細(xì)胞中,直接地或者例如被多孔膜包裹植入患者體中(參閱例如美國(guó)專(zhuān) 利號(hào)4, 892, 538和5, 283, 187 )。引入核酸到有活力細(xì)胞中的可用技術(shù)可 包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡 聚糖、磷酸鉤沉淀方法等的使用。
前肽、核酸、試劑、產(chǎn)物或組合物可用局部方式施用到胂瘤位點(diǎn)或其 他期望位點(diǎn),或者可以以它導(dǎo)向腫瘤或其他細(xì)胞的方式遞送。通過(guò)使用導(dǎo) 向系統(tǒng)例如抗體或細(xì)胞特異性配體,導(dǎo)向療法可用來(lái)更特異地遞送活性劑 到某些類(lèi)型細(xì)胞中。多種原因期望實(shí)現(xiàn)導(dǎo)向,例如如果試劑具有不可接受 的毒性,或如果是非如此需要過(guò)高劑量,或如果是非如此不能進(jìn)入靶細(xì)胞。
劑量
本發(fā)明的前肽、核酸或組合物優(yōu)選以"治療有效量"施用到個(gè)體,這種 有效量對(duì)于個(gè)體足以顯示益處。實(shí)際給藥方案取決于許多因素,包含被治 療的病癥,它的嚴(yán)重度、被治療的患者、所使用的試劑,并由醫(yī)師酌情處 理。
醫(yī)師可基于許多參數(shù)測(cè)定合適劑量,所述參數(shù)包含例如,年齡、性別、 體重、被治療病癥嚴(yán)重度、被施用的有效成分和給藥途徑。
現(xiàn)在接下來(lái)的非限制性例子中會(huì)深入描述本發(fā)明。參照附圖,其中
圖1說(shuō)明了 CatSPP的擴(kuò)增。CatSPP的cDNA序列從人類(lèi)脾cDNA文 庫(kù)中擴(kuò)增。產(chǎn)生大約330 bp的單鏈,與所期待的CatSPP cDNA序列大小相等。
圖2a說(shuō)明了從CatS PP克隆入pQE-30的菌落PCR結(jié)果。
圖2b顯示了 rCatSPP完整閱讀框的DNA和蛋白質(zhì)序列,作為其插入到pQE30中的結(jié)果。
圖3說(shuō)明了 rCatSPP蛋白的純化a) rCatSPP洗脫圖,b)顯示 SDS-PAGE分析來(lái)自于第二個(gè)寬峰的分餾物,如箭頭所指,c)使用抗-多 組氨酸標(biāo)記抗體免疫印跡純化分餾物。
圖4說(shuō)明了 IPTG對(duì)rCatSPP表達(dá)的誘導(dǎo),由SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印 跡證明。a)通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯亮蘭染色分析細(xì)菌裂解產(chǎn)物b)以 抗-多組氨酸標(biāo)記抗體印跡。在每個(gè)圖像的左側(cè)指示分子量標(biāo)記(kDa)。
圖5說(shuō)明了在rCatSPP存在下水解Cbz-Val-Val-Arg-AMC的發(fā)展曲線。 從相同栽體產(chǎn)生并且以相同方式純化的對(duì)照(組氨酸)6 -標(biāo)記蛋白,用作對(duì) 照(500nM)(插圖)。
圖6顯示用于測(cè)定抑制常數(shù)(Ki)的非線性回歸分析曲線圖(Morrison和 Walsh, 1988)。
圖7:組織蛋白酶K、 V、 L和B被rCatSPP蛋白的抑制,使用熒光測(cè)定。
圖8說(shuō)明了 Cat S彈性蛋白活性(elastinlytic activity)的抑制。熒光底 物彈性蛋白-DQ用于監(jiān)控在CatSPP (50 - 500 nM)存在下經(jīng)過(guò)60分鐘將育 的CatS彈性回轉(zhuǎn)。
圖9顯示CatL -類(lèi)蛋白酶在癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)。
圖10a顯示在4種人癌細(xì)胞系中(i-iv: HCT116、U251mg、MDA-MB-231
和PC3 )體外侵襲測(cè)定結(jié)果。
圖10b顯示在MCF-7細(xì)胞中體外侵襲測(cè)定結(jié)果。
圖11顯示評(píng)估rCatSPP蛋白的細(xì)胞毒性或增殖效應(yīng)的MTT測(cè)定結(jié)果。
圖12說(shuō)明了 CatSPP克隆入pRSET A-Fc的菌落PCR分析。
圖13顯示由加入IPTG誘導(dǎo)的、來(lái)自pRSET A載體中rCatSPP-Fc的 表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE和使用抗-多組氨酸標(biāo)記抗體來(lái)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡 分辨。
圖14: rCatSPP-Fc純化。a)顯示了純化圖,顯示了兩個(gè)不同的峰,在大約200分鐘后的尖峰和 在225到250分鐘間的第二個(gè)寬峰。b)顯示來(lái)自純化過(guò)程的被洗脫分餾物 的分析。c)顯示純化分餾物的分析,由使用抗-多組氨酸標(biāo)記單克隆抗體 的蛋白質(zhì)印跡實(shí)現(xiàn)。
圖15說(shuō)明了 Cat S被rCatSPP- Fc的抑制,使用熒光測(cè)定。
圖16說(shuō)明蛋白質(zhì)印跡證明與CatS PP-Fc比較CatS PP的穩(wěn)定性。
圖17說(shuō)明了柱狀圖,顯示在CatSPP Fc存在下PC3侵襲測(cè)定的定量 分析(quantitative summary )。
圖18說(shuō)明了柱狀圖,顯示在CatSPP和CatSPP-Fc重組蛋白存在下 HCT116侵襲測(cè)定的定量分析。
圖19顯示劑量響應(yīng)曲線,用于為MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞中的rCatS PP 和rCatS PP-Fc確定EC50值。
實(shí)施例
材料和方法
從人脾cDNA文庫(kù)(Origene)擴(kuò)增了人CatSPP中17至113殘基,使 用引物CATSPPF (5' TTT TTTGGATCCCAGTTGCATAAAGATCCTAC)和 CATSPPR (5' TTTTTTGTCGACCCGATTAGGGTTTGA),分別含有SamHI 和&/I限制位點(diǎn)(如加下劃線的)。預(yù)期的330 bp條帶可通過(guò)瓊脂糖凝膠 電泳辨認(rèn)。這個(gè)條帶凝膠純化并使用^"OTHI和Sa/I克隆入PQE30 (Qiagen), 為下游控制其整合了 N末端6組氨酸標(biāo)記。陽(yáng)性克隆用菌落PCR鑒定并 且序列與登記號(hào)M90696比對(duì)。單個(gè)驗(yàn)證的克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
關(guān)于克隆CatSPP到pRSET-Fc載體,使用引物CATSPPFCF (5' TTTTTTGGATCCCAGTTGCATAAA GAT) 和 CATSPPFCR (5' TTTTTTGTCGACTATCCGATTAGGGTT)擴(kuò)增DNA序列,再次分別含有6amHI和限制酶位點(diǎn)(如加下劃線的)。擴(kuò)增條帶被凝膠切除并且克 隆到pRSET細(xì)菌表達(dá)載體,所述載體預(yù)先被設(shè)計(jì)為含有IgG2 Fc結(jié)構(gòu)域。 陽(yáng)性克隆用菌落PCR鑒定并且序列與登記號(hào)M90696比對(duì)。單個(gè)驗(yàn)證的克 隆用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
CflW尸尸希Cfl^P戶-Fc ^^《;^趟必
關(guān)于表達(dá)分析,CatSPP陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化入TOP10F'細(xì)胞中并且在搖瓶 (500 ml)中培養(yǎng)直到達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期(A5so 0.5, 37°C)。 CatSPP- Fc陽(yáng)性 克隆的表達(dá)分析,通過(guò)使用大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS林的轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。 在收獲前,兩種重組蛋白的表達(dá),通過(guò)力。入異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG, 1 mM)到細(xì)菌培養(yǎng)物中并且再繁殖4小時(shí)進(jìn)行請(qǐng)導(dǎo)。重懸細(xì)胞沉淀并在50 mM NaH2P04 pH 8.0 (含有8 M尿素、300 mM NaCl和10 mM咪唑)裂解。 在應(yīng)用到帶有N嚴(yán)離子的IMAC柱(HiTrap 1 ml柱,GE Healthcare)前,未 加工的變性裂解液通過(guò)離心(10,000 g,在4。C60分鐘)澄清。在用超過(guò)200 柱體積從8 M減少到0 M尿素的柱上再折疊之前,卩吏用50 mM NaH2P04 pH 8.0 (含有8M尿素、300 mM NaCl和20 mM咪唑)從柱中洗去非特異結(jié) 合物質(zhì)。在以50 mM NaH2P04 pH 8.0、 300 mM NaCl和250 mM咪唑洗脫 前,再折疊的柱結(jié)合物質(zhì)再以20柱體積的50 mMNaH2P04 pH 8.0、300 mM NaCl和20 mM咪唑洗滌。收集蛋白質(zhì)分餾物,除去鹽分到PBS中,并且 通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析以測(cè)定純度和完整性。純化的重組蛋白 儲(chǔ)液使用前保存在-20°C 。
^rCflW尸尸奔賴(lài)爭(zhēng)應(yīng)^虔逸欽蛋冷凝
酶的測(cè)定用于確定rCatSPP抑制人組織蛋白酶S、 L、 K、 V和B (Calbiochem)分解肽的活性的能力。在100 mM醋酸鈉、1 mM乙二胺四乙 酸鹽(EDTA)、 0.1% Brij和1 mM 二硫蘇糖醇(DTT)在pH 5.5存在下,在96 孔微量滴定板中以三個(gè)重復(fù)進(jìn)行測(cè)定。使用熒光底物千氧羰基 (carbobenzloxy)-L-纈氨酰-L-纈氨酰-L-精氨酰酰氨基(arginylamido ) -4-甲 基香豆素(Z-Val-Val-Arg-AMC, 25 pM)監(jiān)控CatS活性,使用千氧羰基-L-苯丙氨酰-L-精氨酰酰氨基-4-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-AMC, 25 pM)進(jìn)行組 織蛋白酶L、 K和V的測(cè)定,并且使用千氧羰基-L-精氨酰酰氨基-L-精氨酰酰氨基-4-甲基香豆素(Z-Arg-Arg-AMC, 25 pM)作為底物進(jìn)行CatB的測(cè) 定。純化的rCatSPP以所需的多種濃度(O-IOOO nM)加入到測(cè)定中。使用 激發(fā)光在395 nm和發(fā)射光在460 nm的Cytofluor 4000熒光分光光度計(jì)進(jìn) 行所有實(shí)驗(yàn)。為證實(shí)rCatSPP - Fc也具有抑制CatS活性能力,在rCatSPP-Fc (0nM-200nM)存在下使用CatS、 Z-Val-Val-Arg-AMC (25 ^M)進(jìn)行熒光測(cè) 定。
通過(guò)RT-PCR分析測(cè)定半胱氨酸組織蛋白酶S、 L、 K和V在一組人 癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)水平。使用完全RNA RT-PCR小量制備試劑盒 (Absolutely RNATM RT-PCR Miniprep kit)從U251mg、 MDA-MB-231、 HCT116和PC3細(xì)胞系中提取出RNA并用分光光度計(jì)定量。使用一步 RT-PCR試劑盒在下列條件進(jìn)行RT-PCR: 5(TC30分鐘、95°C 15分鐘,和 35個(gè)循環(huán)的94°C 1分鐘、55°C 1分鐘和72°C 1分30秒,接下來(lái)是72°C 10 分鐘或者按本文中詳細(xì)內(nèi)容。使用在下面列表中詳述的引物進(jìn)行一系列半 胱氨酸組織蛋白酶擴(kuò)增。擴(kuò)增P-肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)部對(duì)照指示相等的上 樣量。RT-PCR產(chǎn)物分析用瓊脂糖凝膠電泳并且使用Kodak ID 3.4 USB軟 件和數(shù)碼相機(jī)在UV光下采集圖像。
基因RT-PCR引物序列
CatS (F)GGG TAC CTC ATG TGA CAA G
CatS (R)TCA CTT CTT CAC TGG TCA TG
CatL (F)ATG AAT CCT ACA CTC ATC CTT GC
CatL (R)TCA CAC AGT GGG GTA GCT GGC TGC TG
CatK (F)ATG TGG GGG CTC AAG GTT CTG C
CatK (R)TCA CAT CTT GGG GAA GCT GGC C
CatV (F)ATG AAT CTT TCG CTC GTC CTG GC
CatV (R)TCA CAC ATT GGG GTA GCT GGC肌動(dòng)蛋白(F) ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTG
CG
肌動(dòng)蛋白(R) CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT
GC
脊賴(lài)襲縱
4吏用 12 (xm孑U莫(Costar Transwell plates, Coming Costar Corp., Cambridge, MA, USA)的改良博伊登室進(jìn)行體外侵襲測(cè)定。膜以基質(zhì)膠(IOO 昭/cm2) (Becton Dickinson, Oxford, UK)包被并且允許在層流通風(fēng)櫥中過(guò)夜 干燥。在預(yù)定濃度rCatSPP存在下細(xì)胞以每孔500 pi無(wú)血清培養(yǎng)基加入。 所有測(cè)定以三個(gè)重復(fù)執(zhí)行并且侵襲板孵育在37。C和5% C02條件24小時(shí), 之后保留在膜上表面的細(xì)胞被除去而且被侵襲細(xì)胞在卡諾依固定液中固 定15分鐘。干燥后,被侵襲細(xì)胞的細(xì)胞核用含Hoechst 33258 (50 ng/ml) 的PBS在室溫條件染色30分鐘。室插入物(chamber insert)用PBS洗二 遍,包埋入抗焚光衰退封片劑(Citifluor)中并且被侵襲細(xì)胞用Nikon Eclipse TE300熒光顯微鏡觀察。三個(gè)重復(fù)膜中每個(gè)代表性區(qū)域的IO個(gè)數(shù)碼圖像, 使用Nikon DXM1200數(shù)碼相機(jī)在放大20倍時(shí)釆集。使用Lucia GF 4.60 通過(guò)實(shí)驗(yàn)室成像分析結(jié)果,并且以被侵襲細(xì)胞百分比表示。
勿,澤力縱
rCatSPP的細(xì)胞毒性或增殖效應(yīng)通過(guò)使用HCT116結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系 的MTT測(cè)定檢測(cè)。細(xì)胞以每200 pi含1 x 104細(xì)胞的濃度加入96孔板。200 nMrCatSPP (以相同載體在相同條件下產(chǎn)生的對(duì)照蛋白)和僅有載體的對(duì) 照加入到細(xì)胞中并且在37。C和5%(302條件孵育24、 48和72小時(shí)。在這 之后小心除去培養(yǎng)基并且加入200 pi 0.5 mg/ml 3-4,5-二甲基遙唑-2,5聯(lián)苯 四唑鹽溴化物(MTT)并且在37。C孵育2小時(shí)。除去MTT試劑并且不溶性 曱臜(formazan)結(jié)晶用100 pl DMSO溶解。在570 nm測(cè)量吸光度并且結(jié)果 以相對(duì)于每種僅有載體對(duì)照的細(xì)胞活力或增殖百分比表示。所有試驗(yàn)以5 個(gè)重復(fù)進(jìn)行。
結(jié)果和討論先前純化CatSPP是通過(guò)許多不同方法實(shí)現(xiàn)。Maubach和同事從大腸 桿菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生CatSPP,通過(guò)抗GdnHCl濃度梯度再折疊從包涵體分 離相應(yīng)于16至114殘基的肽(Maubach等,1997)。 Guay和同事也在大腸桿 菌中產(chǎn)生PP (17至114殘基),使用另一種方法,作為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)C端融合蛋白產(chǎn)生。重組蛋白再次在包涵體中產(chǎn)生,接下來(lái)在GST-瓊脂糖凝膠柱中親和純化和通過(guò)凝血酶裂解階在GST融和蛋白中除去PP 之前,所述蛋白抗GdnHCl濃度梯度重折疊(Guay等,2000)。所述后面方 法還用于產(chǎn)生CatKPP和CatLPP。這些先前方法都產(chǎn)生生物活性蛋白,但 是很費(fèi)勁和很費(fèi)時(shí),尤其是分離和重折疊包涵體。在確定更快速簡(jiǎn)潔用于 產(chǎn)生CatSPP方法的努力中,本發(fā)明人表達(dá)了具有N末端6組氨酸標(biāo)記的 肽(17至113殘基)并且通過(guò)再折疊IMAC純化蛋白。
使用詳述的基因特異性引物CATSPPF和CATSPPR,編碼前肽結(jié)構(gòu)域 (17至113殘基)的開(kāi)放閱讀框通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從商業(yè)可獲得的 cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增。當(dāng)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)可看見(jiàn)期待大小的帶(圖 )。凝膠萃取后,將所述帶克隆入商業(yè)可獲得的載體(pQE30)中。菌落PCR 分析16個(gè)克隆顯示一條來(lái)自克隆10擴(kuò)增的大約650 bp的帶(圖2a)。這 提示了只有克隆10可能含有成功克隆入pQE-30細(xì)菌表達(dá)載體的CatSPP cDNA序列。
DNA測(cè)序用于充分驗(yàn)證(序列與登記號(hào)M90696比對(duì))(參閱圖2b )。 選擇的克隆用于所有后續(xù)繁殖和發(fā)酵,從中分離rCatSPP種用于后續(xù)研究。
然后分析有效克隆中的rCatSPP表達(dá),首先是對(duì)蛋白過(guò)度表達(dá)并且驗(yàn) 證它含有N末端組氨酸標(biāo)記而且具有期待的16 kDa分子量,并且蛋白的 表達(dá)是在T5啟動(dòng)子調(diào)控下由IPTG誘導(dǎo)。
rCatSPP從pQE-30細(xì)菌表達(dá)載體表達(dá)并且使用柱上再折疊IMAC純 化。如圖3a)中顯示,rCatSPP洗脫圖含有幾個(gè)峰;185分鐘后的尖的初始 峰,接著是在190和195分鐘間的寬峰。從第二個(gè)寬峰的分餾物,如圖3b 中箭頭指示,用SDS-PAGE分辨顯示了單個(gè)高純度的帶,具有大約16kDa 分子量,對(duì)應(yīng)于預(yù)期的(組氨酸)6-標(biāo)記的rCatSPP。圖3c)顯示純化分 餾物的免疫印跡,使用抗-多組氨酸標(biāo)記抗體證實(shí)在大約16 kDa位置組氨酸標(biāo)記物質(zhì)的存在。
rCatSPP表達(dá)被IPTG的誘導(dǎo)被SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡證明(圖4 )。 通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯亮蘭染色分析細(xì)菌裂解液顯示,在被誘導(dǎo)泳道b 中而不在未誘導(dǎo)的泳道a中的大約16 kDa位置存在rCatSPP (圖4a)。轉(zhuǎn) 移細(xì)菌裂解液到硝酸纖維素膜并且用抗-多組氨酸標(biāo)記抗體印跡,證實(shí)僅 在誘導(dǎo)的泳道b中的蛋白表達(dá)(圖4b)。分子量標(biāo)記在每個(gè)圖像的左側(cè)顯 示(kDa)。
最后去鹽化到PBS中后,然后測(cè)試前肽的生物活性。rCatSPP蛋白的 生物活性通過(guò)在預(yù)定濃度rCatSPP(O nM到500 nM)存在下,使用CatS和 熒光底物Cbz-Val-Val-Arg-AMC的熒光測(cè)定來(lái)確定。標(biāo)繪了在rCatSPP存 在下水解Cbz-Val-Val-Arg-AMC的發(fā)展曲線并且觀察了 CatS活性的劑量依 賴(lài)性抑制(圖5)。用相同載體產(chǎn)生并且以相同方式純化的對(duì)照(組氨酸) 6 -標(biāo)記蛋白,用作對(duì)照(500 nM)來(lái)證實(shí)由于rCatSPP干擾了 CatS活性(插 圖)。測(cè)定都以三個(gè)重復(fù)進(jìn)行。
發(fā)展曲線指示了緩慢結(jié)合可逆抑制劑的作用。產(chǎn)生的表觀一級(jí)速率曲 線(first order rate order curve )然后用于非線性回歸分析(Morrison和Walsh, 1988),其中隨時(shí)間熒光的產(chǎn)生[P]能以下面的方程代表 = vst - (Vs - V。) (1- exp(-k。bst) )/k。bs + d (1)
使用GraF^軟件,顯示在圖7a中發(fā)展曲線的值通過(guò)非線性回歸分析 擬合于方程(l)中,產(chǎn)生了 Vs對(duì)[I]的曲線,從中測(cè)定了 Ki(實(shí)測(cè)的)。然后對(duì)其 校正用于說(shuō)明竟?fàn)幍孜?,如方?2)中顯示。
(K^Kk歸)/ (1+ [S]/Km)} (2)
使用這種分析,計(jì)算用rCatSPP抑制CatS的K,值(圖6 )。
關(guān)于這方面更多內(nèi)容在圖7中顯示,在預(yù)定濃度rCatSPP存在下使用 組織蛋白酶K、 V、 L和B(分別是a-d)進(jìn)行熒光測(cè)定。監(jiān)控?zé)晒?0分鐘, 隨時(shí)間標(biāo)繪的RFU產(chǎn)生了熒光發(fā)展曲線。通過(guò)rCatSPP抑制組織蛋白酶產(chǎn) 生表觀一級(jí)速率常數(shù),其用于非線性回歸分析(插圖)能夠測(cè)定抑制常數(shù) (Ki)分別是17.6 nM(± 1.3)、 4.8 nM (± 0.6)和0.62 nM (± 0.14)。所有熒光測(cè)定以三個(gè)重復(fù)進(jìn)行。
關(guān)于確立抗-分解肽活性的確認(rèn),本發(fā)明人隨后使用rCatSPP證明了 它阻斷CatS彈性蛋白活性的能力。焚光底物彈性蛋白-DQ用于監(jiān)控在 CatSPP (50 - 500 nM)存在下,經(jīng)過(guò)60分鐘孵育的CatS彈性回轉(zhuǎn),并且本 發(fā)明人能夠證明這種活性的抑制(圖8)。
用RT-PCR評(píng)估在四種人癌細(xì)胞系中Cat S、 L、 K和V的表達(dá)。組織 蛋白酶的每一種在四種細(xì)胞系中都出現(xiàn)表達(dá)并且擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部 對(duì)照(圖9 )。
基于計(jì)算rCatSPP的全部分解肽的抑制圖,能顯示至少CatS彈性蛋白 活性的證據(jù),本發(fā)明人繼續(xù)分析了肽在侵襲性癌癥模型中阻斷這些蛋白酶 活性的效應(yīng)。關(guān)于這些實(shí)驗(yàn)本發(fā)明人釆用了研究,所述研究通過(guò)基質(zhì)膠包 被改良的博伊登室(Flannery等,2003)檢查肺瘤細(xì)胞的侵襲。這些實(shí)驗(yàn)在代 表了通常類(lèi)型癌癥的細(xì)胞系中執(zhí)行。具體而言這些是PC3 (前列腺癌細(xì)胞 系)、HCT116 (結(jié)腸直腸癌)、U251MG (星形細(xì)胞瘤)、MDA-MB-231 (乳 腺癌)和MCF7 (乳腺癌),結(jié)果顯示在圖10中。圖10說(shuō)明了四種人癌細(xì) 胞系的分析,通過(guò)體外4曼襲測(cè)定實(shí)現(xiàn);a-d: HCT116、U251mg、MDA-MB-231 和PC3。每種細(xì)胞系均顯示在CatSPP存在下肺瘤細(xì)胞侵襲顯著減少。(* = p: S 0.01, ** = p: ^ 0.001, *** = p: S 0.0001)。所有變量以采集10個(gè)數(shù)碼圖 像進(jìn)行三個(gè)重復(fù)并且用于分析腫瘤細(xì)胞侵襲。以平均值的±誤差標(biāo)繪出標(biāo) 準(zhǔn)誤差。使用學(xué)生t檢驗(yàn)(students t-test)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖10b顯示 柱狀圖,其說(shuō)明在CatSPP存在下MCF7肺瘤細(xì)胞侵襲顯著減少(63%)。
用MTT測(cè)定評(píng)估rCatSPP蛋白的細(xì)胞毒性或增殖效應(yīng)。使用HCT116 結(jié)腸直腸癌細(xì)胞,與200nM的rCatSPP、對(duì)照蛋白和僅有載體的對(duì)照共同 孵育,進(jìn)行MTT測(cè)定。結(jié)果(圖11)說(shuō)明重組蛋白對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明 顯作用。所有變量進(jìn)行5個(gè)重復(fù)。
本發(fā)明人繼續(xù)研究在組織蛋白酶前肽上提供Fc部分在侵襲性腫瘤模 型中對(duì)L類(lèi)型組織蛋白酶的抑制效應(yīng)。
使用上述對(duì)CatSPP描述的方法,克隆和表達(dá)了包括C末端Fc部分的組織蛋白酶S前肽(CatSPPFc )。 CatSPP的cDNA序列克隆到pRSET A-Fc 載體中。使用載體特異性引物,從陽(yáng)性轉(zhuǎn)化板選擇8個(gè)克隆用于菌落PCR 分析。由于擴(kuò)增了大約1100bp的帶(圖12),所有8個(gè)克隆均呈現(xiàn)陽(yáng)性。 pRSETA載體中rCatSPP-Fc的表達(dá)通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)。結(jié)果顯示在圖13 中。泳道A、 B、 C和D中含有未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的樣品(分別是B=0.2, C=0.5 和D=0.7 OD (A550 nm))。通過(guò)進(jìn)行SDS-PAGE和使用抗-多組氨酸標(biāo)記 抗體的蛋白質(zhì)印跡分辨樣品。^r測(cè)到具有大約46 kDa分子量的所述組氨酸 標(biāo)記蛋白物質(zhì),與期待大小的rCatSPP-Fc相等。具有OD 0.2的培養(yǎng)物誘 導(dǎo)表達(dá)對(duì)于蛋白產(chǎn)生是最佳的。
通過(guò)N末端組氨酸標(biāo)記特點(diǎn)使用IMAC純化rCatSPP-Fc。結(jié)果顯示在 圖14a)中,純化圖顯示2個(gè)不同的峰,在大約200分鐘后的一個(gè)尖峰,和 在225和250分鐘間的第二個(gè)寬峰。b)來(lái)自純化過(guò)程的洗脫分餾物分析提 示,第一個(gè)峰代表了從柱中非特異性結(jié)合蛋白的洗脫(分餾物1-5),而第 二個(gè)寬峰顯示大約46 kDa物質(zhì)的洗脫,與期待大小的rCatSPP-Fc (分餾物 6-15 )—致。c)通過(guò)使用抗-多組氨酸標(biāo)記單克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡分析 純化的分餾物,其顯示如所期待的rCatSPP-Fc —樣大約46 kDa的組氨酸 才示i己物質(zhì)的存在。
使用CatSPPFc測(cè)量CatS分解肽活性的抑制。rCatSPP-Fc通過(guò)使用熒 光底物Z-VVR-AMC的熒光測(cè)定評(píng)估,測(cè)定在加入Fc結(jié)構(gòu)域后,是否所 述物質(zhì)具有保持它抑制CatS的能力,對(duì)動(dòng)力學(xué)沒(méi)有任何負(fù)面影響。結(jié)果顯 示在圖15中a)說(shuō)明在存在rCatSPP-Fc濃度增加(0 nM至200 nM )情 況下,抑制CatS活性的發(fā)展曲線。a,插圖)Fc對(duì)照蛋白(200nM)對(duì)CatS 活性沒(méi)有可辨別的影響。b)從發(fā)展曲線推斷出速率并且抑制動(dòng)力學(xué)計(jì)算為 8.9nM(士2.5)。測(cè)定重復(fù)三次。
CatS PP相對(duì)CatS PP-Fc的穩(wěn)定性按下述方法評(píng)估。rCatSPP和 rCatSPP-Fc蛋白與HCT116結(jié)腸直腸癌細(xì)胞一起孵育,通過(guò)加入抗體IgG2 Fc-結(jié)構(gòu)域評(píng)估重組蛋白的穩(wěn)定性。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)估上清液樣品(圖 16),測(cè)定在細(xì)胞上清液內(nèi)的穩(wěn)定性。rCatSPP僅能在0 hr檢測(cè)到而 rCatSPP-Fc穩(wěn)定性出現(xiàn)改善,因?yàn)?4 hr后能檢測(cè)到它。至于對(duì)照,也評(píng)估了不含加入蛋白的細(xì)胞上清液(-)并且用麗春紅給膜染色,以證實(shí)上 清液的同等加樣量。以三個(gè)重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
之后在使用前列腺PC3細(xì)胞的體外侵襲測(cè)定中試驗(yàn)了 CatSPPFc對(duì)組 織蛋白酶S的作用。結(jié)果顯示在圖17中。柱形圖顯示在CatSPP Fc (0-32 nM) 存在下PC3侵襲測(cè)定中的定量分析。每個(gè)測(cè)定進(jìn)行三個(gè)重復(fù)并且每個(gè)測(cè)定 計(jì)數(shù)10個(gè)區(qū)域。
在使用其他腫瘤細(xì)胞系的體外侵襲測(cè)定中試驗(yàn)了 CatSPP Fc對(duì)組織蛋 白酶S的作用(圖18 )。 rCatSPP和rCatSPP-Fc蛋白用于使用HCT116結(jié) 腸直腸細(xì)胞系的體外侵襲測(cè)定中。測(cè)定在存在rCatSPP (0 nM至250 nM) 或rCatSPP-Fc (0 nM至50 nM)濃度增加,以及最大濃度的適當(dāng)對(duì)照蛋白情 況下進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)偏差以誤差線標(biāo)繪。測(cè)定重復(fù)三次,對(duì)于其中每個(gè)采集10 個(gè)圖像。平均腫瘤細(xì)胞侵襲的標(biāo)準(zhǔn)偏差以±誤差線標(biāo)繪。
在使用MDA-MB-231細(xì)胞實(shí)施的侵襲測(cè)定中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。圖19 說(shuō)明對(duì)于rCatS PP和rCatS PP-Fc相對(duì)的EC50值。在不同濃度rCatSPP或 rCatSPP-Fc存在下的MDA-MB-231胂瘤細(xì)胞侵襲相對(duì)速率用于非線性回 歸分析和構(gòu)建的S形劑量響應(yīng)曲線。發(fā)現(xiàn)對(duì)于(a) rCatSPP和(b) rCatSPP-Fc 產(chǎn)生的EC50值分別是78.0 nM和8.3 nM。
可以看出,CatSPPFc作為在侵襲測(cè)定中組織蛋白酶S的有效抑制劑, 具有明顯較高的最高抑制性能并且其抑制濃度明顯低于以無(wú)Fc部分 CatSPP所需要的濃度。雖然,期待通過(guò)Fc部分在小程度上加強(qiáng)CatSPP分 子穩(wěn)定性,然而非常驚奇地發(fā)現(xiàn)包含F(xiàn)c部分非常明顯地加強(qiáng)了抑制效應(yīng)。 因此,結(jié)果說(shuō)明包含F(xiàn)c部分的組織蛋白酶前肽增強(qiáng)了在肺瘤侵襲模型中 對(duì)組織蛋白酶L-類(lèi)型蛋白酶活性的抑制。在肺瘤發(fā)生模型中使用組織蛋 白酶的廣譜小分子抑制劑進(jìn)行了其他研究,指示相似效應(yīng)。Joyce和同事 在研究轉(zhuǎn)基因RIP-Tag2鼠中運(yùn)用了 JPM-OEt的應(yīng)用,其是一種廣譜半胱 氨酸組織蛋白酶抑制劑E64的細(xì)胞可滲透類(lèi)似物(Joyce等,2004)。因?yàn)?致瘤的SV40T抗原存在,這些鼠在12-14周形成了胰島瘤。他們證明了 對(duì)這些鼠施用這種廣譜抑制劑能明顯抑制肺瘤發(fā)展的多個(gè)階段,包含動(dòng)物 組織學(xué)分析中高侵襲性癌的發(fā)展。在另一個(gè)研究中,F(xiàn)lannery和同事在阻斷星形細(xì)胞瘤侵襲中,考查了 4-嗎啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯 砜(LHVS)的用途。使用與本發(fā)明人在本文所使用的相同侵襲模型,說(shuō)明 LHVS有效抑制CatS并且在較少程度上抑制Cat, LHVS在50 nM濃度時(shí) 能夠以高達(dá)60 %阻斷U251MG細(xì)胞侵襲(Flannery等,2003 )??傊@些 先前的研究清楚地說(shuō)明了,首先CatL-類(lèi)蛋白酶在這些細(xì)胞系的侵襲過(guò)程 中發(fā)揮的作用,其次它們作為癌癥治療治療靶點(diǎn)的潛力。
盡管有可觀的研究成果,然而關(guān)于這些蛋白酶中每一種在腫瘤發(fā)生中 作用的范圍仍需充分理解。顯然一旦它們被致瘤的細(xì)胞分泌,大量的證據(jù) 指向它們?cè)谄茐膹椥缘鞍住⒛z原和細(xì)胞外基質(zhì)的其他成分中的作用。然而, 現(xiàn)在新出現(xiàn)的這些酶在活化和控制彼此和其他較少密切相關(guān)的蛋白酶(如 金屬蛋白酶)中發(fā)揮作用(Kobayashi等,1993 )。而且,新的證據(jù)加強(qiáng)了 Cat S在破壞基質(zhì)衍生的抗-血管原性因子和在腫瘤發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生前血 管原性因子的作用(Wang等,2005 )。這說(shuō)明這些蛋白酶能比僅消化周?chē)?ECM以允許腫瘤發(fā)展和遷移具有更多作用。
結(jié)論
本發(fā)明人在本文中描述了用于產(chǎn)生組織蛋白酶前肽例如CatSPP的新 的表達(dá)和純化方法。本發(fā)明人證明,通過(guò)4吏用組織蛋白酶前肽(例如 rCatSPP)抑制組織蛋白酶L-類(lèi)型蛋白酶,可弱化腫瘤發(fā)生。給出了本發(fā) 明人在使用不同范圍腫瘤細(xì)胞系的體外侵襲測(cè)定中看出的抑制圖,顯然廣 泛抑制CatL-類(lèi)蛋白酶對(duì)于臨床治療癌癥具有明顯的治療益處。開(kāi)發(fā)能阻 斷腫瘤蔓延(尤其是在體內(nèi)的繼發(fā)灶)的藥劑的能力,對(duì)于共施用細(xì)胞毒 性藥劑的方案具有吸引力。迅速?gòu)募?xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生rCatSPP和成功應(yīng)用 于這些腫瘤細(xì)胞侵襲^^型的能力,提示了它能夠代表設(shè)計(jì)治療性蛋白酶抑 制劑的新方法。
在此通過(guò)引用并入本說(shuō)明書(shū)提及的所有文獻(xiàn)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而 言,本發(fā)明所述實(shí)施方式的各種修改和變化是清楚的,并未脫離本發(fā)明的 范圍和精神。盡管本發(fā)明以聯(lián)系具體優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行描述,也應(yīng)理解 如權(quán)利要求所述本發(fā)明不應(yīng)不當(dāng)?shù)叵抻谒鎏囟▽?shí)施方式。實(shí)際上,對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的、實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的所述方式的各種修改都預(yù)期涵蓋在本發(fā)明中。 參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1. 一種在細(xì)胞或組織中抑制組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶活性的方法,所述方法包括施用組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸到所述的細(xì)胞或組織中。
2. —種在細(xì)胞或組織中抑制組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶過(guò)度表達(dá)的方 法,所述方法包括施用組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸到所 述的細(xì)胞或組織中。
3. —種在需要對(duì)其治療的患者中治療與組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶異常 活性和/或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥的方法,所述方法包括施用組織蛋白酶前肽 或編碼組織蛋白酶前肽的核酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述與組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶 異?;钚院?或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥是胂瘤性疾病、炎性疾病、神經(jīng)退化疾 病、自身免疫性疾病、哮喘或動(dòng)脈粥樣硬化。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述組織蛋白酶 前肽是人組織蛋白酶前肽,其包括與登記號(hào)M90696中公開(kāi)的組織蛋白酶 S蛋白酶氨基酸殘基17至113相應(yīng)的氨基酸序列。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述組織蛋白酶前 肽是人組織蛋白酶前肽,其具有與圖3中氨基酸序列1 - 118相應(yīng)的氨基酸序列。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所迷的方法,其中所述組織蛋白酶前 肽包括抗體Fc部分。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶是組織蛋白酶S。
9. 一種組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸,其用于藥物。
10. —種組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸,其用于治療 與組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶異?;钚院?或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的前肽或核酸,其中所述與組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶異常活性和/或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥是腫瘤性疾病、炎性疾病、神經(jīng)退化疾病、自身免疫性疾病、哞喘或動(dòng)脈粥樣硬化。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的前肽或核酸,其中所述組織蛋白酶前肽是人組織蛋白酶前肽,其包括與登記號(hào)M90696中公開(kāi)的組織 蛋白酶S蛋白酶氨基酸殘基17至113相應(yīng)的氨基酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)所述的前肽或核酸,其中所述組 織蛋白酶前肽是人組織蛋白酶前肽,其具有與圖3中氨基酸序列1-118 相應(yīng)的氨基酸序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的前肽或核酸,其中所述組 織蛋白酶前肽包括抗體Fc部分。
15. 根據(jù)權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)所述的前肽或核酸,其中所述組 織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶是組織蛋白酶S。
16. 組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸在制備用于治療與 組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶異常活性和/或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥的藥物中的 應(yīng)用。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用,其中所述與組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白 酶異?;钚院?或過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病癥是肺瘤性疾病、炎性疾病、神經(jīng)退化 疾病、自身免疫性疾病、哮喘或動(dòng)脈粥樣硬化。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的應(yīng)用,其中所述組織蛋白 酶前肽是人組織蛋白酶前肽,其包括與登記號(hào)M90696中公開(kāi)的組織蛋白 酶S蛋白酶氨基酸殘基17至113相應(yīng)的氨基酸序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用,其中所述組織蛋白 酶前肽是人組織蛋白酶前肽,其具有與圖3中氨基酸序列1 - 118相應(yīng)的氨 基酸序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用,其中所述組織蛋白 酶前肽包括抗體Fc部分。
21. 根據(jù)權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用,其中所述組織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶是組織蛋白酶S。
22. —種藥物組合物,其包括組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物,其中所述組織蛋白酶前肽 是人組織蛋白酶前肽,其包括與登記號(hào)M90696中公開(kāi)的組織蛋白酶S蛋 白酶氨基酸殘基17至113相應(yīng)的氨基酸序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的藥物組合物,其中所述組 織蛋白酶前肽是人組織蛋白酶前肽,其具有與圖3中氨基酸序列1-118 相應(yīng)的氨基酸序列。
25. 根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物,其中所述組 織蛋白酶前肽包括-抗體Fc部分。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物,其中所述組 織蛋白酶L -類(lèi)蛋白酶是組織蛋白酶S。
27. —種重組產(chǎn)生組織蛋白酶前肽的方法,所述方法包括表達(dá)具有N 末端多組氨酸標(biāo)記的組織蛋白酶前肽以及使用金屬離子親和層析(IMAC ) 純化表達(dá)的前肽。
全文摘要
描述了細(xì)胞或組織中抑制組織蛋白酶L-類(lèi)蛋白酶活性的方法和所述方法在治療疾病例如癌癥和炎性疾病中的應(yīng)用。所述方法包括施用組織蛋白酶前肽或編碼組織蛋白酶前肽的核酸。在具體實(shí)施方式
中,前肽是組織蛋白酶S前肽。此外,描述了含有Fc部分的前肽的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101432014SQ200780015724
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者克里斯多佛·斯科特, 吉姆·約翰斯頓, 理查德·別克, 羅伯塔·波爾登, 菲利普·斯諾迪, 馬克·麥克理 申請(qǐng)人:弗森抗體有限公司