p38α拮抗肽突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，涉及ρ38α拮抗肽突變體及其在制備治療心肌缺血 再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] ρ38 是 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase)超家族成員之一，p38 家族主 要有四個亞型，ρ38 α、Ρ38 β、ρ38 γ和ρ38 δ。其中Ρ38 α和Ρ38 β在組織細胞中遍在表 達，而ρ38γ和ρ38δ只在特異的組織中表達。Ρ38α和Ρ38β具有較高同源性，在功能上 也有一定重疊；但ρ38α在大多數(shù)細胞中處于高表達水平而Ρ38β則處于低表達水平，所 以，一般認為ρ38α是Ρ38家族成員的主要亞型。ρ38α最初發(fā)現(xiàn)是因其是一種能夠結(jié)合嘧 啶咪唑類化合物的酶，能夠抑制LPS誘導的炎性因子IL-I和TNF- α在單核細胞內(nèi)的產(chǎn)生。 隨后的研宄表明，ρ38α不僅是炎癥發(fā)展的核心介導因子，在腫瘤生成、細胞存活和氧化應(yīng) 激損傷等方面也發(fā)揮重要作用，因此被認為是治療炎癥及的靶點。目前已設(shè)計出多種ρ38α 抑制劑，它們作用位點雖然不盡相同，但其本質(zhì)是相同的，都是與ATP競爭結(jié)合ρ38的催化 中心，由于人體內(nèi)不同的激酶均有高度相似的腺苷結(jié)合口袋，致使以競爭結(jié)合ATP為作用 機制的ρ38 α抑制劑存在不同程度毒副作用。鑒于Ρ38 α的ATP競爭性抑制劑臨床試驗存 在安全性問題，所以設(shè)計非ATP競爭性ρ38 α抑制劑來替代現(xiàn)有的ATP競爭性抑制劑非常 必要。
[0003] 以 P38 α 與其銜接接頭蛋白 TABl [transforming growth factor-β (TGF-β )- activated protein kinase I(TAKl)-binding protein 1]相互作用為革El點是設(shè)計非 ATP 競爭性ρ38α抑制劑的策略之一。研宄發(fā)現(xiàn)，TABl能夠與ρ38α發(fā)生相互作用，促使其第 180位的蘇氨酸和第182位的酪氨酸發(fā)生雙位點磷酸化而被激活，而這一過程不需要ρ38 上游MAPK激酶ΜΚΚ3/ΜΚΚ6的參與。TABl與ρ38 α的相互作用具有亞型特異性和結(jié)構(gòu)特異 性-即TABl不與ρ38的其他三個亞型ρ38 β、ρ38 γ、ρ38 δ發(fā)生結(jié)合，而且ρ38 α與TABl 相互作用的結(jié)構(gòu)區(qū)域不同于它和ΜΚΚ3/ΜΚΚ6的相互作用區(qū)域?；诖耍菊n題組之前的工 作通過靶向ΤΑΒ1/ρ38 α設(shè)計了一種具有細胞膜滲透性的拮抗肽ΡΤ5,并通過體內(nèi)體外實驗 證明ΡΤ5能夠選擇性的抑制ΤΑΒ1/ρ38 α的相互作用，從而在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型 中減輕心肌的再灌注損傷。急性心肌梗塞是由于冠狀動脈血栓形成后導致的組織缺血而引 起。冠狀動脈的再灌注對于恢復(fù)心肌功能非常重要，但剛開始恢復(fù)血液再灌注后，不但未減 輕反而加重缺血所引起的細胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，因而將這種血液再灌注后缺血性 損傷加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R)損傷。I/R將會帶來一些 不良效應(yīng)，例如氧化應(yīng)激，細胞內(nèi)鈣超載等，這些不良反應(yīng)會導致心肌細胞凋亡。研宄表明， 在缺血再灌注過程中TABl與ρ38α相互作用以及TABl介導的ρ38α旁路活化在其中起關(guān) 鍵作用。
[0004] 目前，能夠有效降低心肌缺血再灌注損傷的干預(yù)策略和治療藥物還非常有限。之 前工作所設(shè)計的ΡΤ5拮抗肽有望成為相關(guān)藥物的先導化合物。然而，ΡΤ5中發(fā)揮拮抗ρ38 α 旁路活化作用的關(guān)鍵氨基酸還是未知的。尋找PT5拮抗肽中相應(yīng)的關(guān)鍵位點將有助于獲得 更精確的結(jié)構(gòu)信息并對多肽進行優(yōu)化，從而為心肌再灌注損傷防治藥物提供先導結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種ρ38 α拮抗肽突變體PT5-2。經(jīng)GST-pull實驗和 Kinase assay實驗證明：ΡΤ5突變體ΡΤ5-2對于TABl與ρ38 α相互作用的抑制能力更強。 [0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種ρ38 α拮抗肽突變體，所述突變體命名為ΡΤ5-2,所述ΡΤ5-2的 氨基酸序列為以下組中的任意一個：
[0008] (1)如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列；
[0009] (2)在SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或 幾個氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
[0010] 優(yōu)選地，所述PT5-2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0011] 通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0012] 本發(fā)明的ρ38α拮抗肽突變體PT5-2也包括對SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的 非保守修飾，只要經(jīng)過修飾的多肽仍然能夠保留P38 α拮抗肽突變體PT5-2的生物學活性 即可。在此類修飾中突變的氨基酸數(shù)目是3個或者更少。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種編碼上述突變體的DNA分子。
[0014] 本發(fā)明提供了一種重組載體，所述載體包括前面所述的DNA分子。
[0015] 所述重組載體可以是病毒載體或者非病毒載體。
[0016] 非病毒載體包括但不限于線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA載體。
[0017] 本發(fā)明的病毒載體包括但不限于腺病毒載體（adenoviral vectors)、腺相關(guān)病 毒載體（adeno-associated viral vectors)、反車專錄病毒載體（retroviral vectors)、 單純皰疼病毒載體（herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒載體（lentiviral vectors)〇
[0018] 如本文中所使用，術(shù)語"載體"應(yīng)理解為意指包含了能夠并入到宿主細胞中并與宿 主細胞基因組重組并整合到宿主細胞基因組中，或作為游離體自主復(fù)制的核苷酸序列的任 何核酸。此類載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA載體、病毒載體等。
[0019] 在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：表達載體、克隆載體，例如適用于原核（如 大腸桿菌等細菌）、低等真核細胞（如酵母）、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞中的載體。 總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達載體中，除了含有 復(fù)制起點外，還可含有標記基因和其他翻譯控制元件。
[0020] 本發(fā)明還提供了包含上述重組載體的宿主細胞。
[0021] 進一步，宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞； 或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏 菌的細菌細胞：真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0, C0S，293細胞、 或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
[0022] 本發(fā)明還提供了前面所述的PT5-2突變體在制備抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用的藥 物中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供了編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子在制備抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 的藥物中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了包含編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子的重組載體在制備抑制TABl/ ρ38α相互作用的藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明還提供了包含前面所述的重組載體的宿主細胞在制備抑制ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用的藥物中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明還提供了前面所述的ΡΤ5-2突變體在制備治療ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用導致 的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明還提供了編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子在制備治療ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 導致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明還提供了包含編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子的重組載體在制備治療TABl/ ρ38α相互作用導致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還提供了包含前面所述的重組載體的宿主細胞在制備治療ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用導致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供了前面所述的ΡΤ5-2突變體在制備治療心肌缺血再灌注損傷的藥 物中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供了編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子在制備治療心肌缺血再灌注損傷的 藥物中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供了包含編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子的重組載體在制備治療心肌缺 血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明還提供了包含前面所述的重組載體的宿主細胞在制備治療心肌缺血再灌 注損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含前面所述的ΡΤ5-2突變 體、編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子、包含編碼ΡΤ5-2突變體的DNA分子的重組載體、或包含 前面所述的重組載體的宿主細胞。
[0035] 進一步，本發(fā)明的所述藥物組合物還包括要學上可接受的載體，所述載體包括但 不限于已經(jīng)被美國食品與藥品管理局認可的而可用于人類或動物的任何佐劑、賦形劑、助 流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、香味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助 懸劑、穩(wěn)定劑、等滲壓劑、溶劑或乳化劑等對組成藥物組合物無副作用的各種形式的載體。
[0036] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過多種手段施用，所述手段例如通過口服、舌下、口 腔、腸胃外、經(jīng)鼻、經(jīng)局部、經(jīng)直腸、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜等。
[0037] 根據(jù)藥物組合物的施用形式，可將藥物組合物制備成相應(yīng)的各種劑型，所述劑型 包括但不限于片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑。
[0038] 本發(fā)明的組合物可以例如呈適于立即釋放或持續(xù)釋放的形式施用。立即釋放或持 續(xù)釋放可以通過使用適合的藥物組合物，或特別是在持續(xù)釋放情形中，通過使用如皮下植 入物或滲透泵等裝置實現(xiàn)。
[0039] 供治療的受試者為經(jīng)歷心肌缺血再灌注損傷的患者，受試者包括但不限于哺乳動 物，如人、狗、貓等。
[0040] 應(yīng)了解，用于任何特定受試者的具體劑量水平和劑量頻率可以變化，并且將取決 于多種因素，包括所用藥物組合物的活性；該藥物組合物的代謝穩(wěn)定性和作用時間長度； 受試者的物種、年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用的模式