AGTCCCATGAATACCCAGAACAATGGCTTAGTCCAGAATGTTGGGTCACTTCCGGGACTCCCTAAAACCTT TCCACACTCAACTGGGTCCTTTTGACCCTCAACGAATTTGGGACTCAAGCTTGGACTCGCCGAGTCCAAGGACGGAC TCGCCGAGTCTATCTCGTGTTCTCACTAGATCTTCAATTTCTGATGTACAACTCTTGATCAAAGGATAGATCTATGC TCCAAGGACCGTTCTAGCACGCAAATTTACAAACTTTACGTGTTTGCATGGGACTTTAAGCTCAAAAGGTCCTAAAA TAAGCCCTTGAATTGCATGGGGCCTTTCTTGGGTGGAAAAGCACCCTCAACTTGTAAAAACTTTTATTCAATCATCA AATGTCAACTACATTTTACAAGTTTCAGAAATCTAATTATTGAAACTAATATCATCCTTCAGCCCGATGCGCCTAGT ATGCTGCAAATGTTTAACCCTACTCAGTCCCTTCATGAGGGGATCTACTAGGTTCTCATCTGATGATACCCTCTTTG CCACAAGGAGTCCTTCTATTCGATGTCTGATGAAATGGTATTTTCTGTCAATGTGCCTAGATCTCCCGTGATCTCTT GGTTTCCTTAGCCAAAGCAACCGCACTTTTTCTGTCACAGAAAAGTTTCATTGGCTCCTTTATAGCTGGTACAACTC CAGGTCTCCGATGAAGTTCTTTAGCCATATTGCTCTTTGCTACCTCGCTGCTGCTATATACTCT。
[0045] 2.同源性搜尋與查新
[0046] 將測序獲得的如上序列，在 NCBI 網(wǎng)站（http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/) 上進行比對，未見相同或者重復序列，說明如它為新的、歐當歸特有的核苷酸序列，可建立 歐當歸特異的SCAR標記。
[0047] 實施例2用本發(fā)明方法特異擴增歐當歸的基因
[0048] 1、實驗方法
[0049] (一）根據(jù)實施例1得到的歐當歸特異的SCAR標記（SEQ ID NO. 1所示的序列）， 設計1對引物，合成。
[0051] (二）PCR 擴增
[0052] 1、模板制備
[0053] 檢測不同物種：取選取了 18個不同物種或者品種基因組DNA作為模板，它們分別 是：甘肅岷縣當歸，日本當歸，四川阿壩當歸，甘肅平涼當歸，湖北當歸，四川九寨當歸，歐當 歸（第7個泳道），云南麗江當歸，四川綿陽當歸，銀杏，荔枝，龍眼，青果，金銀花，梔子花，靈 芝，龍荔，趕黃草。分別稀釋成IOng/μ 1備用。
[0054] 鑒別日本當歸、歐當歸和當歸：1、2和3是日本當歸，分別來自重慶，四川峨眉，延 吉吉林；4和5是歐當歸，來自長春吉林和四川甘孜；6是正常岷縣當歸。
[0055] 基因提取方法同實施例1。
[0056] 2、PCR 擴增：
[0057] (I)PCR 體系（10 μ 1)
[0058]
[0059] 充分混勾后，于離心機12000rpm離心15s，置于PCR儀（Applied Biosystems Veriti?96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA) 〇
[0060] (2) PCR擴增條件
[0061]
[0062] 3、瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度根據(jù)其目的片段的大小而定）。
[0063] 詳見《精編醫(yī)學分子生物學實驗指導》（中國醫(yī)藥科技出版社，主編：傅俊江）
[0064] (1)脂糖凝膠的配置：用電子天平稱取0.8g瓊脂粉，加入IXTAE 40ml，放入微波 爐中充分溶解（中火至沸騰，中低火至沸騰2次），置于實驗桌上，加入EB 2 μ 1，混勻，待冷 卻至50°C備用；
[0065] (2)用0. 75mm 16孔寬齒梳，配制膠板，將制膠板放入制膠槽中，將溶解的瓊脂糖 (約50°C )，倒入其中，直至厚度為6_(如有氣泡要把氣泡趕出），待其在室溫下充分凝固 后備用；
[0066] (3)點樣：
[0067] (4) 100V 電泳 45min ;
[0068] 4、圖像攝?。海˙IO-RAD，Universal Hood II )
[0069] 二、實驗結果
[0070] 如圖3所示，本發(fā)明設計的引物可以從歐當歸中擴增出特異性片段，而當歸和日 本當歸沒有擴增出特異性條帶，其他品種植物基因組也沒有擴增出任何條帶。
[0071] 如圖4所示，本發(fā)明設計的引物可以從2個分別來自吉林長春和四川甘孜的歐當 歸中擴增出特異性片段，而一個正品當歸和3個分別來自重慶、四川峨眉和吉林延吉的日 本當歸沒有擴增出特異性條帶。
[0072] 實驗結果說明，本發(fā)明SEQ ID NO. 2~3所示引物的特異性良好，可以特異、有效 擴增歐當歸的基因，能夠有效鑒別歐當歸。
[0073] 實施例3本發(fā)明歐當歸檢測試劑盒和使用方法
[0074] 一、試劑盒組成
[0075] 本試劑盒含有：
[0076] CTAB 提取緩沖液（200ml);
[0077] 2XTaq Master Mix，其中，引物可以選用 SEQ ID NO. 5 ~6、SEQ ID NO. 7 ~8、SEQ ID NO 9~10所示引物中的一對引物或者多對引物（500 μ I);
[0078] 陰性對照模板DNA(日本當歸或當歸的DNA) -管（50 μ 1);
[0079] 陽性對照模板DNA (歐當歸DNA) -管（50 μ 1);
[0080] 滅菌 ddH20 (1500 μ 1)。
[0081] (一）CTAB提取緩沖液
[0086] 二、檢測方法
[0087] (一）PCR 擴增
[0088] I、CTAB提取緩沖液提取待檢樣本DNA。
[0089] 2、進行PCR擴增：
[0090] 具體如下：
[0091] 不同品種 DNA 1 μ I (50ng/ μ I)
[0092] 2 X Taq Master Mix 5 μ I
[0093] ddH20 4 μ I
[0094] 充分混勻后，12000rpm離心30s ;
[0095] 注：2XTaq Master Mix，同時取不同DNA模板設定陽性和陰性對照
[0096] 3、放入 PCR 儀上（Mastercycler 5331PCR 儀器，德國 Eppendorf，或者其它 PCR 儀 器如 Applied Biosystems Veriti?96-Well Thermal Cycler)，采用如下程序。
[0097]
[0098] (二）瓊脂糖凝膠電泳：
[0099] 1、脂糖凝膠的配置：用電子天平稱取0· 8g瓊脂粉，加入0· 5 X TAE 40ml，放入微波 爐中充分溶解（中火至沸騰，中低火至沸騰2次），置于實驗桌上，加入EB 2ul，混勻，待冷 卻至50°C備用；
[0100] 2、用0.75mm 16孔寬齒梳，配制膠板，將制膠板放入制膠槽中，將溶解的瓊脂糖 (約50°C )，倒入其中，直至厚度為6_(如有氣泡要把氣泡趕出），待其在室溫下充分凝固 后備用；
[0101] 3、點樣：注意加樣順序，并加上DNA的分子Marker
[0102] 4、100V 電泳 45min ;
[0103] (三）結果檢測與分析
[0104] 在凝膠成像儀下觀察結果，結果照相保存，并分析結果。
[0105] 綜上，本發(fā)明提供的檢測試劑盒和檢測方法可以有效鑒定歐當歸，特異性強，耗時 短，檢測快速，具有良好的臨床應用前景。
【主權項】
1. SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。2. 檢測SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備歐當歸檢測試劑中的用途。3. 根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于：所述檢測試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所 示核苷酸序列的試劑。4. 根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于：所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3所 示的引物對。5. 根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于：所述歐當歸是傘形科植物歐當歸 Levisticum officinalis Koch06. -種檢測歐當歸的試劑盒，其特征在于：包括檢測SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的 相關試劑。7. 根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列的試劑。8. 根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3 所示的引物對。9. 一種檢測歐當歸的檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： a，DNA提?。禾崛〈龣z樣本中的DNA ; b，檢測：用權利要求6~8任意一項所述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
【專利摘要】本發(fā)明公開了歐當歸的核苷酸序列，還公開了檢測前述序列的試劑在制備歐當歸檢測試劑中的用途，以及歐當歸的檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明檢測試劑盒和檢測方法可以準確、有效的鑒別歐當歸，特異性強，耗時短，應用前景良好。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN104946636
【申請?zhí)枴緾N201510377945
【發(fā)明人】傅俊江, 梅志強, 張春, 成競梁, 魏春莉
【申請人】四川醫(yī)科大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月30日