和P4為引物，進行重疊 PCR。其反應 體系如下：
反應程序如下：98°C預變性I min;98°C 10 s，55°C 15 s，72°C I min，進行30個循 環(huán)；72°C延伸5 min，降溫至4°C。最終得到P43-DPE表達單元。
[0024] 實施例2 :整合載體pDGI-7S6-P43-DPE的構建 將質粒P7S6和pDGIEF，分別用Sal I和Xma I進行雙酶切，回收和 載體pDGIEF基因片段，經Τ4連接酶連接過夜后轉化入萬.co/i DH5 α感受態(tài)細胞，涂布到 LB固體培養(yǎng)基(含100 yg/mL 5/7C)上，37°C過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，提取質粒，進行雙酶 切驗證。驗證正確的質粒被命名為PDGI-7S6。
[0025] 將質粒PDGI-7S6和pP43-DPE，分別用Nhe I和Sal I進行雙酶切，回收基因片段 PDGI-7S6和P43-DPE，經T4連接酶連接過夜后轉化入凡co/i DH5 α感受態(tài)細胞，涂布含 有s/7c(100 μ g/mL)的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，抽提質粒，進行雙酶切和測 序驗證。驗證及測序正確的質粒命名為PDGI-7S6-P43-DPE (圖1)。
[0026] 實施例3 :染色體整合 將重組質粒PDGI-7S6-P43-DPE用XhoI線性化后轉化入宿主菌漢1A751感 受態(tài)中，涂布到LB固體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL 5/7C)上，37°C培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆轉化 子即為漢 lA751_DPE_spc (圖 2)。制作重組菌漢 lA751_DPE_spc 感 受態(tài)，將帶有Cre基因的pTSC質粒轉化入感受態(tài)中，利用含有應（250 μ g/mL)的LB平板 篩選，挑取陽性克隆子，用牙簽接種到含有應（250 μ g/mL)和分c (100 μ g/mL)的雙抗 性平板和僅含應（250 μ g/mL)的抗性平板，選取僅具有故杭性而不具有57c抗性的陽性 克隆子，再提高溫度，丟失質粒PTSC即獲得重組菌漢lA751/7oz-DPE。
[0027] 實施例4:重組菌的發(fā)酵 I. DPE酶活測定方法：lmL的反應體系中，加入800 yL的用磷酸鹽緩沖液（50mM， pH7. 0)溶解的100g/L的D-果糖，200 yL的發(fā)酵液，55°C保溫lOmin，然后煮沸IOmin以終 止酶反應。
[0028] 2.用HPLC檢測D-阿洛酮糖的生成量，計算酶活。酶活單位（U):每分鐘催化產生 Iymol D-psicose所需要的酶的量。
[0029] 3.用接種環(huán)從平板上挑取新鮮的菌落接種至種子培養(yǎng)基中，37°C、200rpm，培養(yǎng) 12~14h。以3%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200rpm，并定時取樣，測定0D_，酶活數(shù) 據（圖3)。
[0030] 種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨（l〇g/L)，酵母提取物（5g/L)，NaCl(10g/L)，以純凈水配 制。
[0031] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖（15g/L)，酵母膏（15g/L)，NaCl (8g/L)，MgSO4 (lg/L)， Na2HP04(lg/L)，pH 7· 25,以純凈水配制。
【主權項】
1. 一株基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達D-阿洛酮糖3-差向異 構酶的重組枯草芽孢桿菌，其組成為lA751/7 〇z-DPE，分類命名為枯草芽孢桿菌 SK38. 002,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO :M 2015258。2. 權利要求1所述的基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達D-阿洛酮糖 3_差向異構酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于包括含有來源于梭狀芽胞桿菌 (ATCC 35704 的 DPE 酶基因的整合載體 pDGI-7S6-P43-DPE ;再利 用整合載體PDGI-7S6-P43-DPE將DPE酶基因和抗生素抗性基因整合至 枯草芽孢桿菌1A751染色體上，然后利用Cre重組酶敲除染色體上的5/7C抗性基因，獲得一 株表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的重組枯草芽孢桿菌lA751/7oz-DPE，命名為 sM) SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。3. 根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于具體步驟為： (1) 以整合載體PDGIEF為出發(fā)載體，將質粒p7S6用Sal I /Xma I雙酶切得到 片段；將整合載體 pDGIEF 用 Sal I /Xma I 雙酶切，將 片段連入相應酶切位點，得到新的整合載體PDGI-7S6 ; (2) 設計引物將DPE酶基因擴增出來，在引物中引入Nhe I /Sal I酶切位點，通過重疊 延伸PCR將啟動子P43融合在DPE酶基因上游，將擴增的DPE酶基因連接至pMD-19T中，得 到質粒 T-P43-DPE ; (3) 將整合載體？061-756和！'-?43-0?￡同時用他61/5&11雙酶切，將？43-0?￡表達 基因構建至整合載體PDGI-7S6中，得到整合載體pDGI-7S6-P43-DPE ; (4) 將整合載體pDGI-7S6-P43-DPE轉入枯草芽孢桿菌1A751感受態(tài)，發(fā)生同源重 組，P43-DPE表達基因和整合至枯草芽孢桿菌1A751染色體上，得到 lA751-P43-DPE-spc ； (5) 將溫敏性質粒pTSC導入整合的重組枯草芽孢桿菌lA751-P43-DPE-spc中，在IPTG 的誘導下，表達重組酶Cre，在Cre酶的作用下，TW71和/(0^66位點發(fā)生重組，抗生素抗性 基因5/7C被刪除，提高溫度培養(yǎng)，pTSC質粒丟失，獲得一株無抗性基因的重組枯草芽孢桿菌 lA751/7oz-DPE，命名為SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。4. 根據權利要求2或3所述的構建方法，其特征在于為增強表達，在DPE基因的上游添 加啟動子P43, P43啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中1-300位所示。5. 根據權利要求2或3所述的構建方法，其特征在于整合載體pDGI-7S6-P43-DPE，其 中含有所述SEQ ID NO. 1中301-1170位所示的DPE酶基因、作為篩選標記的抗生素抗性基 因片段以及淀粉酶同源臂<3?成。6. 權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌1A751/ A^r-DPE的應用，其特征在于可用于生 產D-阿洛酮糖，在化學、食品和制藥領域中的應用。
【專利摘要】基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法，屬于酶基因工程技術領域。以整合載體pDGIEF為出發(fā)載體，刪除原有的壯觀霉素(spc)抗生素抗性基因，引入lox71-spc-lox66新的抗生素抗性基因片段，得質粒pDGI-7S6；將ATCC 35704的DPE酶基因，在其上游融合P43啟動子構建P43-DPE，將其構建至pDGI-7S6中得pDGI-7S6-P43-DPE；再轉化1A751感受態(tài)，在淀粉酶同源臂作用下，P43-DPE和lox71-spc-lox66整合至1A751染色體上；利用Cre/lox系統(tǒng)將spc抗性基因敲除，得一株食品級安全的產D-阿洛酮糖3-差向異構酶的1A751/lox-DPE，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SK38.002，保藏編號：CCTCC NO:M 2015258。發(fā)酵液總酶活達到6U/mL，具有重要的工業(yè)應用價值。CCTCC NO：M 201525820150428
【IPC分類】C12P19/24, C12N1/21, C12N15/74, C12R1/125, C12P19/02
【公開號】CN104946577
【申請?zhí)枴緾N201510294696
【發(fā)明人】江波, 沐萬孟, 何偉偉, 張濤
【申請人】江南大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月2日