基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu) 酶的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，涉及一種DPE酶在枯草芽孢桿菌中的食品級(jí)表達(dá)，屬 于酶基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（DPE酶)屬于D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱DTE)家 族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構(gòu)，是生產(chǎn)稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨(dú)或 與其他酶偶聯(lián)合成多種碳水化合物，被廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、食品和制藥等領(lǐng)域。目前，DPE酶 可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化，利用D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0003] 隨著由過量高能量食物攝入引發(fā)的一系列慢性病在世界范圍內(nèi)的爆發(fā)，膳食結(jié)構(gòu) 越來越受到人們的關(guān)注。新型的蔗糖替代品的開發(fā)和研宄仍是功能性甜味劑領(lǐng)域具有重要 的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的當(dāng)務(wù)之急。D-阿洛酮糖是一種天然己酮糖，D-阿洛酮糖擁有蔗糖甜度的70%， 能量值卻只有蔗糖的〇. 3%，具有較高的溶解度，較低的血糖反應(yīng)。因此它是一種理想的甜味 劑，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認(rèn)定為GRAS食品。此外D-阿 洛酮糖還可以減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業(yè)中有很大的應(yīng)用前景。
[0004] 自然界中，D-阿洛酮糖的含量極少，近年來通過新技術(shù)開發(fā)可實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)。 D-阿洛酮糖的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)合成法存在工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物多、分離純化 困難、食品安全性等問題。而通過D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（D-psicose 3-epimerase， DPEase，EC 5. I. 3. 30)把D-果糖差向異構(gòu)化為D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化法因具有反應(yīng)簡(jiǎn) 單、產(chǎn)物單一、純化步驟容易等優(yōu)點(diǎn)而逐漸吸引了眾多科學(xué)家的關(guān)注，也成為D-阿洛酮糖 商業(yè)化生產(chǎn)的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。
[0005] 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌的一個(gè)種，有長(zhǎng)期制備發(fā)酵食品 的歷史，是非致病的，且不產(chǎn)生毒素和致熱致敏蛋白，被美國(guó)食品藥物管理局（FDA)和中國(guó) 農(nóng)業(yè)部等部門批準(zhǔn)為食品級(jí)安全菌株。表達(dá)系統(tǒng)沒有明顯的密碼子偏 好性，表達(dá)產(chǎn)物不容易形成包涵體，具有很強(qiáng)的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和純 化等后續(xù)操作，并且遺傳背景研宄比較清楚，并具有多年的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一株表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的食品級(jí)安全的重組枯 草芽孢桿菌，并可用于轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖。對(duì)D-阿洛酮糖的食品生產(chǎn)具有重要 的意義。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一株基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達(dá) D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌，其組成為lA751/7〇z-DPE，分類命名為 SK38. 002,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO : M 2015258〇
[0008] 所述的基于Cre/lox系統(tǒng)的無抗性基因染色體整合的表達(dá)D-阿洛酮糖3-差 向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括含有來源于梭狀芽胞桿菌（0 O ?5 iri ο? ?? sciflifefldATCC 35704的DPE酶基因的整合載體pDGI-7S6-P43-DPE ;再利用整合載體 PDGI-7S6-P43-DPE將DPE酶基因和抗生素抗性基因7οζ71-5/7^整合至枯草芽孢桿 菌) 1Α751染色體上，然后利用Cre重組酶敲除染色體上的5/7C抗性基 因，獲得一株表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌lA751/7 〇z-DPE，命名為 SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。
[0009] 重組菌的制備方法，其具體步驟為： (1)以整合載體pDGIEF(NCBI-Gene ID: 86278326)為出發(fā)載體，將質(zhì)粒P7S6用 Sal I /Xma I雙酶切得到片段；將整合載體pDGIEF用Sal I /Xma I雙 酶切，將^?71-577^片段連入相應(yīng)酶切位點(diǎn)，得到新的整合載體pDGI-7S6。
[0010] (2)設(shè)計(jì)引物將DPE酶基因擴(kuò)增出來，在引物中引入Nhe I /Sal I酶切位點(diǎn)，通過 重疊延伸PCR將啟動(dòng)子P43融合在DPE酶基因上游。將擴(kuò)增的DPE酶基因連接至pMD-19T 中，得到質(zhì)粒T-P43-DPE。
[0011] (3)將整合載體 pDGI-7S6 和 T-P43-DPE 同時(shí)用 Nhe I /Sal I 雙酶切，將 P43-DPE 表達(dá)基因構(gòu)建至整合載體PDGI-7S6中，得到整合載體pDGI-7S6-P43-DPE。
[0012] (4)將整合載體pDGI-7S6-P43-DPE轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌1A751感受態(tài)，發(fā)生同源 重組，P43-DPE表達(dá)基因和整合至枯草芽孢桿菌1A751染色體上，得到 lA751-P43-DPE-spc。
[0013] (5)將溫敏性質(zhì)粒pTSC導(dǎo)入整合的重組枯草芽孢桿菌lA751-P43-DPE-spc中， 在IPTG的誘導(dǎo)下，表達(dá)重組酶Cre，在Cre酶的作用下，7oz71和7〇冰6位點(diǎn)發(fā)生重組，抗 生素抗性基因5/7C被刪除，提高溫度培養(yǎng)，pTSC質(zhì)粒丟失。最終獲得一株無抗性基因的重 組枯草芽孢桿菌 lA751/7oz-DPE，命名為UaciBw1S SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。
[0014] 為增強(qiáng)表達(dá)，在DPE基因的上游添加啟動(dòng)子P43, P43啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中1-300位所示。
[0015] 整合載體pDGI-7S6-P43-DPE，其中含有所述的DPE酶基因 （SEQ ID NO. 1中 301-1170位所示）、作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因7〇ζ71-5/7^Λ?66片段以及淀粉酶同 源臂<3〃#。
[0016] 所述的重組枯草芽孢桿菌lA751/7oz-DPE的應(yīng)用，可用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖，在化 學(xué)、食品和制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供一株表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組 枯草芽孢桿菌 1A751/7oz-DPE，命名為UaciBw1S SK38. 002,即 CCTCC NO :Μ 2015258。其可以D-果糖為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖。該重組枯草芽孢桿菌在化學(xué)、食品和制 藥領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0018] 生物材料樣品保藏：一株枯草芽孢桿菌002,已保藏于 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO : M 2015258,保藏日期2015年4月28日。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :整合載體pDGI-7S6-P43-DPE的構(gòu)建過程。
[0020] 圖2 :染色體整合及抗性基因5/X敲除。
[0021] 圖3 :重組菌SK38. 001的發(fā)酵及酶活曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 !P43-DPE表達(dá)單元的構(gòu)建 通過重疊 PCR引入P43啟動(dòng)子，利用引物對(duì)P1/P2擴(kuò)增P43啟動(dòng)子，利用引物對(duì)P3/P4 擴(kuò)增DPE酶基因連接，設(shè)計(jì)引物如下： Pl: 5' -CCGCTAGCTG ATAGGTGGTA TGTTTTC-3' P2: 5' -TAATAAATAC CATGCTTCAT GTGTACATTC CTCTCT-3' P3: 5' -AGAGAGGAAT GTACACATGA AGCATGGTAT TTATTA-3' P4: 5' -GTCGACTTAC TTCCATTCAA GCATG -3' 通過PCR的方法，利用Pl和P2為引物獲得PCR產(chǎn)物1。利用P3和P4為引物獲得PCR 產(chǎn)物2。
[0023] 以PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2為模板，利用Pl