一種日本血吸蟲抗原的融合蛋白及其在哨鼠早期監(jiān)測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及構(gòu)建一種日本血吸蟲抗原的新型重組分子，以免疫學(xué)檢測方法應(yīng)用于 日本血吸蟲易感水域哨鼠的早期監(jiān)測，屬于寄生蟲病的免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，我國日本血吸蟲病的防治工作已取得較為顯著的成效，長江流域一些省、自 治區(qū)和直轄市分別達(dá)到傳播阻斷、傳播控制和感染控制的階段。為達(dá)到"消除血吸蟲病"這 一目標(biāo)，做好流行區(qū)疫情的監(jiān)測和預(yù)警是當(dāng)前血吸蟲病防治工作中的重要內(nèi)容之一。
[0003] 利用哨鼠對(duì)日本血吸蟲易感水域進(jìn)行監(jiān)測已成為日本血吸蟲感染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重 要手段，可起到預(yù)警作用。20世紀(jì)90年代，南京及武漢市的長江周邊水域即開展了哨鼠的 監(jiān)測工作。隨后，湖南、湖北、江西、安徽、江蘇、四川和云南等多省均利用哨鼠測定法對(duì)長江 重點(diǎn)水域進(jìn)行血吸蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作。
[0004] 在實(shí)際應(yīng)用中，哨鼠通常在暴露于水體后的40天左右被解剖，以觀察體內(nèi)的成蟲 和沉積在肝臟的蟲卵。此時(shí)，通過小鼠的解剖發(fā)現(xiàn)蟲體再進(jìn)行預(yù)警的發(fā)布，無疑在時(shí)間上明 顯滯后，不能滿足早期預(yù)警和降低血吸蟲感染風(fēng)險(xiǎn)的需要；且大量哨鼠在飼養(yǎng)中所產(chǎn)生的 經(jīng)濟(jì)成本以及在剖殺時(shí)所投入的人力成本均較高，降低成本亦是哨鼠應(yīng)用中迫切需要解決 的問題。因此，尋找適合的檢測分子、采取相應(yīng)的血清學(xué)檢測方法對(duì)哨鼠進(jìn)行早期監(jiān)測顯得 尤為重要。這樣既起到早期預(yù)警的作用，又降低了經(jīng)濟(jì)和人力成本，并且最大程度地避免其 中所涉及的動(dòng)物倫理學(xué)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可以用于哨鼠早期監(jiān)測的新型日本血吸蟲抗原分子。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于監(jiān)測日本血吸蟲易感水域哨鼠的融合蛋白 GST-(Sj23HD)n，在日本血吸蟲23kDa膜抗原分子的基礎(chǔ)上，將其大親水肽段進(jìn)行了多（η) 次重復(fù)，再與日本血吸蟲谷胱甘肽（GST)進(jìn)行融合表達(dá)，以此對(duì)日本血吸蟲感染的小鼠進(jìn) 行免疫學(xué)檢查，適用于對(duì)長江重點(diǎn)水域哨鼠的監(jiān)測。
[0007] 本申請(qǐng)中的實(shí)例采用三次重復(fù)，即η = 3,融合蛋白GST- (Sj23HD) 3，所述 的GST- (S j23HD) 3蛋白是將23kDa膜蛋白大親水肽段進(jìn)行三次重復(fù)，中間以柔性肽 (GSGGSGGSGGSG)相連；再與質(zhì)粒載體上的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST)進(jìn)行偶聯(lián)。
[0008] 所述的23kDa膜蛋白大親水肽段的三次重復(fù)序列一（Sj23HD)3是采用人工合成方 法制備，其基因序列為SEQ ID NO: 1。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種制備與純化所述的GST-(Sj23HD)jil3合蛋白的方法，是將編 碼（Sj23HD)j^核苷酸片段插入到表達(dá)載體pGEX-6P-l (購自北京拜爾迪生物科技有限公 司）中構(gòu)建重組表達(dá)載體GST-(Sj23HD)n/pGEX-6P-l，然后將重組表達(dá)載體GST-(Sj23HD) n/ PGEX-6P-1轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21 (DE3)中表達(dá)該GST-(Sj23HD)n融合蛋白。
[0010] 本申請(qǐng)中的實(shí)例GST-(Sj23HD)Jil3合蛋白的表達(dá)在于將（Sj23HD) 3的核苷酸片 段SEQ ID NO: 1插入到一種表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體GST-(Sj23HD)3/pGEX-6P-l (如 圖1)，然后將重組表達(dá)載體GST-(S j23HD) 3/pGEX-6P-l轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，表達(dá) GST-(Sj23HD)3 融合蛋白。
[0011] 所述的GST-(Sj23HD)3蛋白的核酸序列是SEQ ID N0:2,其氨基酸序列是SEQ ID N0:3〇
[0012] 本發(fā)明提供一種工程菌表達(dá)GST-(Sj23HD)J4合蛋白的方法。將含有重組表達(dá)質(zhì) 粒GST-(Sj23HD) 3/pGEX-6P-l的單個(gè)菌落接種到選擇性培養(yǎng)基LB (1 %的蛋白胨，0. 5%的酵 母抽提物，1 %氯化鈉，氨卞青霉素100 μ g/mL)中，37°C振搖過夜。第二天按1:100稀釋接 種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)3h (0D600 ~ 0. 8)，加入終濃度ImM異丙基硫代半乳 糖苷（IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-(Sj23HD)3(如圖2)。
[0013] 所述的GST-(Sj23HD)3融合蛋白的純化是該分離純化方法利用了 GST-(Sj23HD) 3 的C末端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，可以與鎳螯合膠結(jié)合的特點(diǎn)，選用鎳螯合親和層析柱進(jìn)行親和 純化，成功地捕獲了表達(dá)產(chǎn)物中的GST- (Sj23HD) 3融合蛋白，目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度可以達(dá)95 % 以上（如圖3)。
[0014] 所述的GST_(Sj23HD)J4合蛋白的應(yīng)用，是用于通過免疫學(xué)方法檢測日本血吸蟲 感染小鼠血清中的抗體，可以用于日本血吸蟲易感水域哨鼠的監(jiān)測。
[0015] 本發(fā)明利用23kDa膜蛋白大親水肽段的三次重復(fù)偶聯(lián)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行融合 表達(dá)的特點(diǎn)，增加了其穩(wěn)定性和抗原性，可以更好地與血清中相應(yīng)的抗體結(jié)合提高了對(duì)日 本血吸蟲感染小鼠檢出的敏感性和特異性，適用于對(duì)日本血吸蟲易感水域哨鼠的監(jiān)測。
[0016] 由如下實(shí)施案例，GST-(Sj23HD)3蛋白適合于檢測飼養(yǎng)4周的哨鼠，以判斷其感染 情況。這樣將監(jiān)測點(diǎn)由以往的哨鼠飼養(yǎng)6周提前至4周，且避免因大量剖殺小鼠而帶來的 倫理學(xué)問題。
【附圖說明】
[0017] 圖1表達(dá)GST_(Sj23HD)3融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建模式圖。
[0018] 圖2 GST-(Sj23邢)3融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖
[0019] 泳道1.不含任何質(zhì)粒的宿主菌E. coli BL21(DE3)的表達(dá)產(chǎn)物
[0020] 泳道2.含表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-l轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的表達(dá)產(chǎn)物
[0021] 泳道3.含重組表達(dá)質(zhì)粒GST-(Sj23HD)3/pGEX-6P-l轉(zhuǎn)化子細(xì)菌的表達(dá)產(chǎn)物。 GST-(Sj23HD)3融合蛋白的大小約51. 3kDa。
[0022] 泳道4.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
[0023] 圖3 GST-(Sj23HD)3融合蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖
[0024] 泳道1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物
[0025] 泳道2. GST_(Sj23HD)3融合蛋白的純化產(chǎn)物。
[0026] 圖4 GST_(Sj23HD)3蛋白與血吸蟲感后不同時(shí)期小鼠血清的免疫印跡檢測
[0027] 泳道I :GST_(Sj23HD)Jill^蛋白與血吸蟲未感染小鼠血清反應(yīng)
[0028] 泳道2 :GST-(Sj23HD)3融合蛋白與40條血吸蟲尾蝴感染3周小鼠血清反應(yīng)
[0029] 泳道3 :GST_(Sj23HD)3融合蛋白與40條血吸蟲尾蝴感染4周小鼠血清反應(yīng)
[0030] 泳道4 :GST_(Sj23HD)3融合蛋白與40條血吸蟲尾蝴感染5周