一種利用est-ssr分子標(biāo)記快速鑒定辣椒品種金椒純度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體提供了一種利用EST-SSR分子標(biāo)記快速鑒定辣椒 品種金椒純度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒，屬于茄科，是一年或多年生草本植物。辣椒以其果實(shí)特有的辣味、色澤和營(yíng) 養(yǎng)成分已成為一種重要的世界性蔬菜。大量研宄表明辣椒果實(shí)中含有的抗氧化類物質(zhì)可以 保護(hù)生物有機(jī)體免受氧化傷害和提高機(jī)體免疫力。另外，辣椒中辣椒素類物質(zhì)能夠加速能 量和脂類的新陳代謝及降低癌癥細(xì)胞的發(fā)生率。隨著大眾對(duì)辣椒營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分的充 分認(rèn)識(shí)，栽培面積逐年增加。
[0003] 種子質(zhì)量直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力，開(kāi)展作物種子純度檢測(cè)對(duì) 保證種子質(zhì)量具有重要意義。作物品種鑒定的常用方法主要包括種子形態(tài)鑒定、田間種植 形態(tài)鑒定和同工酶電泳技術(shù)鑒定等。種子形態(tài)易受環(huán)境條件影響，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性較差；田 間種植形態(tài)鑒定存在周期較長(zhǎng)，成本較高，工作量較大，并且表型易受栽培措施和環(huán)境條件 的影響，嚴(yán)重影響品種鑒定的效率及準(zhǔn)確性，越來(lái)越不能滿足育種工作和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的需要； 利用同工酶技術(shù)鑒定作物品種純度雖然準(zhǔn)確、可靠，但同工酶標(biāo)記具有組織和器官特異性， 信息量非常有限，多態(tài)性不夠豐富。隨著辣椒新品種數(shù)量的不斷增加，傳統(tǒng)的鑒定方法難以 有效區(qū)分遺傳關(guān)系較近的雜交種。
[0004] 分子標(biāo)記技術(shù)能夠從DNA水平上揭示子代與親本間的遺傳差異，不受環(huán)境條件和 栽培措施的影響，無(wú)組織、器官及發(fā)育特異性，能夠檢測(cè)微小的變異，不受植株生長(zhǎng)季節(jié)的 限制，多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高，可以大大縮短鑒定時(shí)間。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，使 得從基因組水平上檢測(cè)辣椒雜交種真?zhèn)魏图兌瘸蔀榭赡?。EST-SSR(expressed sequence tag-simple sequence repeat)標(biāo)記，是根據(jù)EST序列中的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列開(kāi)發(fā)的一種標(biāo) 記類型，是一類由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)目的 差異檢測(cè)多態(tài)性。EST-SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好、對(duì)DNA 質(zhì)量要求不高、操作簡(jiǎn)單易行、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，與基因組SSR標(biāo)記相比，EST-SSR 標(biāo)記不僅降低了開(kāi)發(fā)成本、提高了開(kāi)發(fā)效率，而且節(jié)省了開(kāi)發(fā)時(shí)間，顯著提高了其利用價(jià) 值。近年來(lái)，隨著辣椒全基因組測(cè)序的完成，辣椒豐富的EST序列資源為EST-SSR標(biāo)記的開(kāi) 發(fā)提供了便利條件。如何利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)辣椒品種純度的鑒定成為亟待解決的問(wèn)題之 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種利用EST-SSR分子標(biāo)記 快速鑒定辣椒品種金椒純度的方法，該方法采用專門設(shè)計(jì)的EST-SSR引物，以金椒的葉片 基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的特異譜帶對(duì)待檢測(cè)金椒的品種純度進(jìn)行檢 測(cè)，采用這種方法可以在金椒植株生長(zhǎng)的任何時(shí)期進(jìn)行鑒定，能夠?qū)㈦s交種與母本自交種、 父本自交種區(qū)分開(kāi)來(lái)；對(duì)DNA質(zhì)量要求不高且需要量少；成本較低、操作簡(jiǎn)單；重復(fù)性和穩(wěn) 定性較好；快速高效；準(zhǔn)確性高，應(yīng)用推廣前景廣闊，為開(kāi)展辣椒制種和良種的及時(shí)銷售提 供科學(xué)依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明所針對(duì)的辣椒品種為金椒，金椒是山東省華盛農(nóng)業(yè)股份有限公司經(jīng)多年研 宄選育出的中辣豐產(chǎn)干、鮮兩用椒。該雜交組合苗期35-50天，定植至干椒采收90-120天。 植株高90-100厘米，株幅70-80厘米左右；門椒著生節(jié)位10-13節(jié)；嫩莖和葉片上有明顯的 絨毛。果實(shí)羊角形，果長(zhǎng)12-15厘米，果肩徑2. 1-2. 3厘米左右，鮮椒單果重15-21g，干椒 單果重2. 5-3. lg。嫩果綠色，成熟果深紅色、自然晾干速度快、商品果率高。干椒果皮內(nèi)外 紅色均勻，干椒色價(jià)值高。本品種適宜全國(guó)各地辣椒主載產(chǎn)區(qū)，最適宜為內(nèi)蒙古等嗜干椒地 區(qū)。
[0007] 為了對(duì)金椒進(jìn)行品種純度的鑒定，獲得母本和父本的優(yōu)良雜交品種， 本發(fā)明的發(fā)明人首先提供了一對(duì)EST-SSR引物，命名為C1HS1，其正向序列為 5' -AGTTTTAAGAGCAAGGAGGCTC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；反向序列為 5' -ATCCAACCCAATCCCCAGTC-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示，
[0008] 在獲得上述引物之后發(fā)明人利用其對(duì)待測(cè)品種金椒的雜交種及其親本的葉片基 因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，具體過(guò)程如下：
[0009] (1)提取金椒雜交種及其親本葉片基因組DNA ;
[0010] ⑵以第⑴步提取的基因組DNA為模板，用EST-SSR引物ClHSl進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0011] PCR 反應(yīng)體系為 20yL，其中包括 10XPCR Buffer 2yL，0.4mM dNTPs，引物各 10 μ M，IU Taq DNA聚合酶，模板100ng，無(wú)菌超純水補(bǔ)齊至20 μ L ;
[0012] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，35個(gè) 循環(huán)；72°C終延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物保存于10°C ;
[0013] 發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，針對(duì)本發(fā)明的發(fā)明目的，以及專門設(shè)計(jì)的特異性引 物，擴(kuò)增程序中將退火溫度設(shè)置為57°C時(shí)，擴(kuò)增效果最好，最終檢測(cè)的結(jié)果更加貼近與實(shí)際 情況，故而將本發(fā)明的退火溫度設(shè)定為57°C。
[0014] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μ L上樣緩沖液混合，之后經(jīng)丙烯酰胺質(zhì)量 體積比為10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，160ν恒定電壓電泳I. 5h，銀染顯色進(jìn)行帶型 統(tǒng)計(jì)；
[0015] 其中所采用的非變性聚丙烯酰胺凝膠中丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為 29 ： 1 ；
[0016] 所采用的上樣緩沖液選自IOX甘油凝膠上樣液；
[0017] (4)根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果鑒定"金椒"雜交種的純度，判定標(biāo)準(zhǔn)為：
[0018] 母本具有 120bp、200bp、250bp、270bp 特異譜帶；父本具有 120bp、200bp、250bp、 260bp 特異譜帶；雜交種具有 120bp、200bp、250bp、270bp、400bp、450bp 特異譜帶；
[0019] 根據(jù)上述鑒定結(jié)果，可以換算金椒品種純度（％) = (1-n/N) X 100%，其中N為待 測(cè)辣椒種子數(shù)目，η為單獨(dú)具有父本譜帶特征或單獨(dú)具有母本譜帶特征或既不同于"金椒" 譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數(shù)目。
[0020] 利用上述方法，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)金椒品種純度的快速檢測(cè)，能夠不受栽培措施和環(huán)境 條件的影響；無(wú)器官、組織及發(fā)育特異性：該方法在植株生長(zhǎng)的任何時(shí)期均可進(jìn)行鑒定；多 態(tài)性豐富、共顯性遺傳：能夠?qū)㈦s交種與母本自交種、父本自交種區(qū)分開(kāi)來(lái)；對(duì)DNA質(zhì)量要 求不高且需要量少；成本較低、操作簡(jiǎn)單：該方法在苗期即可進(jìn)行鑒定，節(jié)省大量人力、物 力和土地資源；重復(fù)性和穩(wěn)定性較好；快速高效：7d之內(nèi)即可完成種子純度鑒定工作；準(zhǔn)確 性高：該方法從基因組水平上揭示子代與親本間的遺傳差異，克服了田間表型鑒定帶來(lái)的 誤差；應(yīng)用推廣前景廣闊：可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)"金椒"雜交種純度，為開(kāi)展辣椒制種和良種 的及時(shí)銷售提供科學(xué)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為本發(fā)明雜交種"金椒"種子檢測(cè)特征引物的PCR電泳圖譜，
[0022] 其中，Pl為"金椒"母本；Fl為多組"金椒" Fl雜交種；P2為"金椒"父本；M為分 子量標(biāo)準(zhǔn)；
[0023] 結(jié)果顯示："金椒"Fl雜交種擁有來(lái)自父、母本的6條清晰條帶，其中Fl雜交種與 父母本條帶相比400bp處兩條代更清晰，可作為特征帶來(lái)做純度區(qū)分；
[0024] 圖2為不同PCR退火溫度對(duì)"金椒"商品種子樣品的純度檢測(cè)結(jié)果的影響電泳圖 譜；
[0025] 其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pl為"金椒"母本；Fl為"金椒" Fl雜交種；P2為"金椒" 父本，
[0026] 結(jié)果顯示，隨著Tm值增大，PCR條帶逐漸減少，且Fl代雜交種400bp處特征帶越 明顯；最終可以確定最佳退火溫度在57°C ;
[0027] 圖3為不同DNA模板量對(duì)"金椒"商品種子樣品的純度檢測(cè)結(jié)果的影響電泳圖譜，
[0028] 其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pl為"金椒"母本；Fl為"金椒" Fl雜交種；P2為"金椒" 父本，
[0029] 結(jié)果顯示，DNA模板量從50ng至500ng均可用于"金椒"商品種子樣品的純度檢 測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；下數(shù)實(shí)施例中的百分比除特殊注明外，均為重量百分比。
[0031] 實(shí)施例1金椒品種